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卵泡刺激素(Follicle-stimulating Hormone,FSH)是由垂体前叶产生的一种糖蛋白类促性腺激素,对促进卵泡的生长发育,调控卵巢各种性激素的合成与分泌发挥着重要作用。FSH的浓度剂量对卵泡发育的启动和周期、卵泡到达成熟的时间以及成熟卵泡数目均至关重要。在畜牧生产上,FSH被广泛用于母畜的同期发情、超数排卵、乏情发情诱导及卵巢疾病的治疗等方面。然而,国内FSH制剂存在着来源不一、提炼纯度参差不齐和批次间质量不均一等问题。同时,目前用于测定FSH制剂生物效价的方法具有操作繁琐、成本高以及准确性差等不足。所以建立一套方便、快捷、有效的FSH生物活性检测方法,对于提高FSH在家畜繁殖生产应用中的高效性和安全性具有重要指导意义。因此,本研究首先对不同细胞进行FSH刺激反应敏感性筛选,确定了以猪卵泡颗粒细胞为研究对象;其次利用转录组测序技术分析了 FSH刺激下卵泡颗粒细胞中基因表达变化规律,并运用实时荧光定量PCR技术验证和筛选出了其中表达变化极显著的基因;最后通过FSH剂量梯度刺激处理,进一步筛选出了 FSH剂量依赖性表达的基因,找到一个基因LHCGR的表达量与F S H剂量呈现线性相关性,为后续FSH生物活性检测体系的建立奠定了基础。主要研究内容如下:1、FSH刺激反应敏感性的细胞筛选鉴于卵巢癌细胞和猪颗粒细胞都有FSH的受体FSHR的存在,本试验选择人卵巢癌细胞株 CAOV-3、ES-2、NIH:OVCAR-3、OVCAR-3、SKOV-3 和猪颗粒细胞,40IU/L浓度的FSH处理48h后,采用半定量PCR方法检测各细胞中FSH调控基因的表达情况。结果显示猪颗粒细胞中FSH相关调控基因的表达存在明显的差异变化,而人卵巢癌细胞株中FSH刺激下基因表达量没有明显变化,选用猪颗粒细胞进行后续基因筛选试验。2、FSH刺激下颗粒细胞中基因表达变化的分析依据上述试验的研究结果,同时为了得到更多FSH调控的候补基因,本章通过转录组测序技术,对FSH(40IU/L)处理18h后的卵泡颗粒细胞进行基因表达变化的分析,结果显示,FSH刺激下差异显著表达的基因一共有190个,其中上调的基因有85个,下调的基因有105个。从中选择FSH上调基因中差异显著表达倍数由大到小的 17 个基因,分站为MTHFD2、PAG1、LHCGR、CTSL、TSHZ1、PAFAH1B2、SDC1、IGF1、MESDC2、ALG2、DCTPP1、SAT2、CCDC71、HSD3B1、ADAM10、MRPL22、STAR,利用实时定量PCR技术进行检测,结果显示,LHCGR、PAFAH1B2、IGF1、CCDC71、HSD3B1、STAR具有极极显著性差异(P<0.001),PAG1、SDC1、SAT2、ADAM10、MRPL22 有极显著差异(P<0.01),MTHFD2、CTSL、TSHZ1、DCTPP1差异显著(P<0.05),MESDC2、ALG2 差异不显著(P>0.05)。3、FSH剂量依赖基因的筛选运用实时荧光定量PCR技术对差异表达极显著(P<0.001)的基因LHCGR、PAFAH1B2、IGF1、CCDC71、HSD3B1和STAR进行FSH剂量梯度(0、20、40、60、80、100IU/L)刺激处理,结果显示,基因PAFAH1B2、IGF1、CCDC71、HSD3B1和STAR的表达量没有随着FSH剂量增加而增加,基因LHCGR的表达量与FSH剂量梯度呈线性增长趋势。以基因LHCGR表达量为纵坐标,FSH浓度梯度为横坐标做趋势图,趋势线R2接近1,说明FSH浓度在20～100IU/L之间时,随着FSH浓度的增加,基因LHCGR表达量呈线性增加。本试验通过转录组测序筛选出FSH刺激下差异表达显著的基因,运用实时荧光定量PCR筛选出随着FSH浓度增加表达量线性变化的基因,为后续建立一套方便、快捷、有效的FSH生物活性检测方法奠定基础。