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肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)简称肝癌，是恶性程度极高的肿瘤，在我国有着较高的发病率和死亡率，目前，临床对肝癌的诊治仍然十分困难。随着现代分子生物学，基因工程技术和蛋白质工程技术的发展，基因工程抗体的诞生为肿瘤的诊断和治疗带来了希望，尤其是单链抗体的应用成为免疫基因治疗的热点。我室成功的构建了一二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体(hdsFv)，提高了抗体的稳定性，降低了亲本鼠源性抗肝癌单链抗体的免疫原性，而其亲和性和特异性无明显下降。CD3是主要分布于成熟T淋巴细胞表面的分子，与TCR非共价结合形成TCR／CD3复合物，构成T淋巴细胞活化信号，而CD3ζ链在TCR／CD3信号转导中起重要作用。本研究将抗肝癌hdsFv的基因与人T细胞活化信号CD3ζ基因融合，构建了肝癌靶向性T细胞的嵌合受体，并在人PBMC和Jurkat T淋巴瘤细胞中表达，为制备肝癌靶向性T细胞奠定了实验基础。 1．构建真核表达载体pcDNA3-hdsFv-CD3ζ。采用RT-PCR从正常人外周血T淋巴细胞总RNA中克隆CD3ζ的胞内区及跨膜区基因，经测序，与GenBank公布的序列一致。用PCR从含有抗肝癌单链抗体的原核表达载体第四军医大学硕士学位论文 pET一22b(+)一hdsFv中克隆其基因序列，经测序，与已知序列相同。将二者序列重组导入真核表达载体pcDNA3，构建重组表达载体peDNA3一hdsFv一CD3乙，经酶切鉴定序列分析与GenBank公布的CD3乙和已知的hdsFv序列相同。 2.肝癌靶向性T淋巴细胞活化融合基因hdsFv一CD3心的表达与定位检验。将构建好的真核表达载体pcDNA3一hdsFv一CD3心用脂质体法转染JurkatT淋巴瘤细胞，经G418筛选获得正常生长的阳性克隆，用Westernblotting检测表明转染后Jurkat细胞中有hdsFv一CD3心融合蛋白的表达。再经细胞化学染色鉴定和灰度分析，hdsFv--CD3心表达于Jurkat细胞的细胞膜上，经修饰的Jurkat细胞可表达较高量的CD3心分子。用RT一PCR从经hdsFv一CD3心修饰的Jurkat细胞中检验出了hdsFv的表达。 3.hdsFv一CD3心修饰的Jurkat和PBMC的功能检验。将hdsFv一CD3心修饰的Jurkat细胞与HepGZ细胞共培养，发现Jurkat细胞粘附在HepGZ上，说明了经hdsFv一CD3乙修饰的Jurkat细胞具有良好的靶向性。再将pcDNA3一hdsFv一CD3心用脂质体法转染pBMC，经细胞化学染色鉴定，CD3心的表达量增加，证实hdsFv一CD3心导入PBMC中。由于活化的T细胞表达CD25，用hdsFv一CD3心修饰活化的的PBMC，经直接免疫荧光染色和FCM分析CD25的表达增加。用hdsFv一CD3心修饰活化的PBMC的培养液上清进行IL一2的生物活性检测，结果证实修饰后的PB毗的IL一2分泌增加。hdsFv一CD3心修饰的PBMC，与肝癌H即G2细胞共培养，以未转染的PBMC与HepGZ细胞共培养做对照，培养6h后，AnnexinV荧光染色检测HepGZ细胞的凋亡，结果表明经hdsFv一CD3心修饰活化的PBMC可以较好的诱导HepGZ细胞的凋亡。将hdsFv一CD3心、hdsFv修饰的PBMC与未转染的PBMC与肝癌HePGZ细胞和宫颈癌H。1a细胞按50:1的效靶比共培养，结果表 4第四军医大学硕士学位论文明，hdsFv一CD3乙、hdsFv修饰的PBMC均可显著杀伤HepGZ细胞，但以hdsFv一CD3心修饰的PBMC杀伤作用最强，共培养6h后，HepGZ细胞即有死亡，12h后死亡细胞进一步增加，18h时，转染hdsFv和hdsFv一CD3心的PBMC对H即G2细胞的杀伤率分别可达到62.39%和75.85%。转染hdsFv一CD3心的PBMC也可显著杀伤Hela细胞，18h时可达63.13%。转染hdsFv一CD3心的PB毗对Hela细胞杀伤率较高除与CD3乙有活化T细胞的功能外，还与PBMC培养时加入了IL一2引起的非特异性活化有关，应属于非特异性活化杀伤。 本研究成功的克隆了CD3心的胞内区及跨膜区基因，构建了抗肝癌hdsFv与T淋巴细胞活化信号CD3心嵌合受体的真核表达载体penNA3一hdsFv一Cn3心，转染入PB讹和JurkatT淋巴瘤细胞，并以此为基础进行了T淋巴细胞活化与功能检验。修饰后的PBMC和肝癌H即G2细胞共培养，与未修饰的PBMC相比，能较好的诱导H即G2细胞的凋亡。 综上所述，我们首次构建了抗肝癌单链抗体融合CD3心的基因，制备了具有肝癌靶向性的PBMC和JurkatT淋巴细胞。该实验结合了杀伤性T细胞的抗肿瘤作用与协同刺激分子两大研究热点，使体液免疫与细胞免疫相结合，利用了TCR/CD3心中抗原识别和信号转导的独立性，将抗体分子的导向作用和T细胞活化信号相结合，构建的肿瘤特异性T细胞的杀伤功能由于不受栩C限制具有一定的临床应用价值，可以提高抗肿瘤综合免疫治疗的水平。