糖尿病是以高血糖为特征的代谢性疾病,在我国具发病率高达9.2%,死亡率达到0.71%,其中2型糖尿病人数占糖尿病总人数的90%以上。肝脏糖代谢异常是诱发糖尿病直接因素之一。正常肝脏葡萄糖处于稳态,由糖异生和糖原分解所调控的肝葡萄糖生成(HGP)对于体内葡萄糖稳态的维持至关重要,其中糖异生的作用尤为显著。因此,探索糖异生的调控机制有助于阐明2型糖尿病发生的机制并开发有效治疗策略。为了筛选糖异生的关键抑制因子,本文建立了以糖异生关键基因Pck1和G6Pc为靶标的双荧光素酶报告系统筛选体系,证明了nemo like kinase(NLK)能显著抑制肝脏糖异生从而抑制HGP,并阐释了其调控糖异生的机制。NLK是一种进化保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)相关的激酶,在各种组织和器官中广泛表达。目前研究表明,NLK参与调控多种信号通路,如Wnt/β-catenin信号通路、Notch信号通路、NF-κB信号通路等。此外,NLK直接调控一些转录因子,如c-Myb、FOXO1等。通过对转录因子和信号通路的调节,NLK参与了很多生物学过程,如肿瘤发生、胚胎发育、骨质形成和生长,以及细胞凋亡、增殖和分化等。然而,NLK在糖脂代谢中的作用尚不明确。在本研究中,我们首先通过双荧光素酶报告系统筛选激酶c DNA文库,发现NLK能够显著抑制Pck1和G6pc报告基因的活性。NLK对糖异生表达基因和HGP的抑制作用进一步在野生型和NLK敲除(NLK-KO)的小鼠的原代肝细胞中进行了验证,而NLK的激酶活性突变体K167M对糖异生无抑制效果,提示NLK对糖异生的抑制作用依赖于其激酶活性。其次,我们发现NLK通过调控CRTC2和FOXO1来抑制肝细胞糖异生。基于FIMO转录因子结合位点预测和STRING蛋白互作网络分析,本研究发现CREB和FOXO1可能是直接与NLK互作并受其调控的转录因子。进一步研究发现,NLK可以和CRTC2(CREB的共激活因子)、FOXO1直接相互作用并抑制CRTC2和FOXO1诱导的糖异生,但对CREB诱导的糖异生无明显作用。CRTC2和FOXO1的下调能够抵消NLK-KO小鼠的原代肝细胞中糖异生基因表达的升高。这些结果表明NLK通过调控CRTC2和FOXO1抑制肝细胞糖异生。最后,我们阐释了NLK调控CRTC2和FOXO1的机制。我们发现NLK能够促进CRTC2的出核转运并降低其稳定性,但K167M对CRTC2核定位和稳定性无明显影响。进一步研究发现,NLK能够促进蛋白酶体途径依赖的CRTC2降解。对NLK调控FOXO1的机制研究发现,NLK能够促进持续性激活突变体FOXO1-CA出核,但对磷酸化位点突变的FOXO1-CA无影响。此外,FOXO1的表达量也和NLK成负相关,但是NLK对FOXO1蛋白水平的调控并不受蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂氯喹(Chlq)的影响。进一步研究发现,NLK对FOXO1表达量的调控主要依赖于对FOXO1转录自激活的抑制作用。这些结果显示,NLK通过其激酶活性促进CRTC2的出核转运及降解;NLK通过其激酶活性促进FOXO1的出核转运,从而抑制其转录自激活,导致FOXO1蛋白水平的降低,最终表现为肝细胞糖异生的抑制。综上所述,NLK通过其激酶活性促进CRTC2和FOXO1的出核转运,导致CRTC2被降解,FOXO1的自转录活性被抑制,从而抑制肝细胞中糖异生。本研究揭示了NLK在糖异生过程中的调控作用以及机制,为2型糖尿病的治疗提供了潜在的治疗靶点。