草酸脱羧酶的无载体固定化及化学修饰的研究

来源 :广西民族大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:haoyigyaoatcs31
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草酸(HOOC-COOH)是自然界中酸性最强的有机二元酸,它以草酸盐的形式广泛的存在于植物,微生物和包括人在内的动物体内。人们食用高草酸含量的食物后容易的造成草酸在人体内的积累,进而引发多种病理状态。许多原发性的高草酸尿患者需要密集的透析和器官移植,这大大增加了患者的痛苦和经济压力,因此需要寻求一种安全的从体内去除草酸盐的方法。实验优化了基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET32a/YvrK诱导表达草酸脱羧酶的条件,制备得到草酸脱羧酶粗提液,酶活为36.8U/mL,蛋白含量为1.12mg/mL,比活力为32.86U/mg。为了获得缓解泌尿系统草酸盐结石病症的酶制剂,用无载体固定化方法—交联酶聚集体(CLEAs)制备交联草酸脱羧酶聚集体。用30%的乙醇对草酸脱羧酶粗提液进行沉淀分离提纯,纯化了2.7倍,酶活回收91.2%;在戊二醛浓度为0.06%、pH5、添加牛血清蛋白(BSA)0.5g/L、4℃冰箱36r/min振荡的条件下处理酶聚集体2h,得到交联草酸脱羧酶聚集体,酶活回收达95.4%;酶学性质研究表明,相对游离酶,交联草酸脱羧酶聚集体(oxdc-CLEAs)的耐酸性、耐热性、耐胰蛋白酶降解能力均有提高。本研究为草酸脱羧酶的应用开发打下了基础。为了降低草酸脱羧酶的免疫原性提高它的稳定性。使用快速蛋白液相色谱系统(AKTA-FPLC)提纯草酸脱羧酶,优化右旋糖酐修饰草酸脱羧酶的条件,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和红外光谱(InfraredSpectroscopy,IR)来表征修饰后的蛋白质分子质量和结构的变化,并考察草酸脱羧酶修饰前后的热稳定性、pH稳定性及对胰蛋白酶的抗性。结果:高碘酸钠与右旋糖酐活化质量比为1:1,右旋糖酐与草酸脱羧酶质量比为200:1,修饰反应6h得到修饰酶;SDS-PAGE和IR分析表明修饰后酶的分子量和蛋白结构明显改变;经右旋糖酐修饰草酸脱羧酶稳定性明显提高。为草酸脱羧酶作为药物治疗泌尿系统结石打下基础。
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