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第一部分:大鼠椎间盘软骨终板细胞凋亡体外模型的建立目的:建立大鼠椎间盘软骨终板细胞凋亡体外模型;方法:为了模拟椎间盘内部低营养低代谢环境,采用低胎牛血清培养法培养椎间盘软骨终板细胞作为诱导凋亡条件,设置浓度梯度分别含0%,1%,3%,5%,8%,10%胎牛血清,筛选最佳浓度,检测凋亡率、凋亡蛋白表达;结果:低胎牛血清培养组细胞发生形态改变,DAPI染色阳性细胞增多;流式细胞仪检测示凋亡率随着FBS浓度降低而升高,1%为最有效诱导凋亡浓度;Western blot示FAS、caspase-3、PARP、细胞色素C表达在1%FBS组明显高于10%。结论:低胎牛血清培养法能诱导体外培养的软骨终板细胞发生凋亡,caspase家族可能参与可这一过程。第二部分大鼠椎间盘软骨终板细胞凋亡机制的的探索目的:软骨终板细胞凋亡是终板退变、变薄重要原因,后者是椎间盘退变的始动因素。本研究的目的在于探索低血清诱导椎间盘软骨终板细胞凋亡的分子机制;方法:取3月龄SD大鼠椎间盘软骨终板,序贯消化法获取细胞原代培养,以1%FBS培养48h为诱导凋亡条件,试验分为1%FBS培养组、10%培养组、1%+caspases8抑制剂(Z-IETD-FMK)组、1%+caspase9抑制剂(Z-LEHD-FMK)组及阳性对照组DMSO组,分别处理细胞48h,后流式细胞仪检测凋亡率、western blot检测procaspase-8、9, active caspase-8、9及active caspase-3的表达;结果:低胎牛血清培养组细胞发生形态改变;流式细胞仪检测凋亡率与10%培养组(26.1%±2.1%)相比,1%培养组细胞凋亡明显增加(40.8%±0.84%), caspase9抑制剂(Z-LEHD-FMK)组能够有效降低低血清引起的细胞凋亡(26.3%±2.56%,P<0.05),而caspases8抑制剂(Z-IETD-FMK)组细胞凋亡却没有得到明显改善(41.3%±2.63%);1%FBS作为诱导条件促进procaspase-9的激活而对procaspase-8激活无明显影响,Z-LEHD-FMK能有效抑制这一激活过程,caspase-3在z-LEHD-fink (caspase-9抑制剂)处理组表达量降低;结论:本试验结果证明低胎牛血清诱导下的椎间盘软骨终板细胞凋亡主要是依赖caspase-9途径凋亡的,并最终导致终板退变和椎间盘退行性疾病。第三部分椎间盘内注射大鼠Caspase-3RNA干扰质粒对椎间盘退变的影响目的:研究慢病毒介导的大鼠caspase-3siRNA的抗凋亡作用及其对大鼠椎间盘退变的影响;方法:为了获得体外椎间盘退变模型我们建立了双后肢大鼠模型,待生长至3月龄大小时,用微量注射器分别向椎间盘软骨终板内注射20ul caspase-3siRNA慢病毒载体(C3)、PBS液,将动物分为正常为正常对照组、造模组、PBS组、C3组,分别在注射后的2w、4w、8w、24w行腰椎X线检查,后杀死大鼠取脊柱制作石蜡切片,HE染色观察大体形态并进行组织学分级评分,免疫组化检测椎间盘内caspase-3蛋白含量,TUNEL分析软骨终板细胞的凋亡情况;结果:Caspase-3miRNA慢病毒载体内转染后,C3组caspase-3蛋白表达量明显降低;X线检查和组织学评估显示C3组大鼠退变性改变明显受抑制,TUNEL染色的结果显示C3处理组较对照组软骨终板细胞凋亡降低;结论:我们的研究结果证明沉默软骨终板细胞中caspase-3基因的表达能有效阻止细胞凋亡,进而调节椎间盘退变。