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研究背景:空气污染,按国际标准化组织(ISO)定义:一般指由人类活动或自然过程导致某些物质进入大气,当达到一定量,持续一定时间后引起人类及其他物种健康危害、舒适程度降低及其他不适等的现象。在空气污染的颗粒物(particulate matter)中,空气动力学当量直径小于等于2.5微米,可以进入人的呼吸系统的颗粒物被称为PM2.5,它能较长时间悬浮于空气中,其在空气中含量浓度越高,就代表空气污染越严重。虽然PM2.5只是地球大气成分中含量很少的组分,但它对空气质量和能见度等有重要的影响。与较粗的大气颗粒物相比,PM2.5粒径小,面积大,活性强,易附带有毒、有害物质(例如,重金属、微生物等),且在大气中的停留时间长、输送距离远,因而对人体健康和大气环境质量的影响更大。在空气污染颗粒物中,PM2.5对人类健康的危害最大,其可逃避机体上呼吸道粘膜防御系统的过滤清洁作用,深入至肺泡。肺组织中的巨噬细胞在防御PM2.5中发挥着关键的作用,巨噬细胞通过其表面的突出、伪足或一些模式识别受体将PM2.5包裹吞入胞内,促使某些细胞因子、趋化因子的释放,引发肺部炎症反应及氧化应激反应。这些反应是肺部抵御外来入侵物质必要的,但长期过度PM2.5的刺激会导致炎症反应及氧化应激反应的失衡,必会引发呼吸道疾病。结核病由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)入侵肺部的一种慢性传染性疾病,Mtb可入侵全身各个器官,对人类健康的危害甚是严重。巨噬细胞介导的免疫反应是机体抗Mtb感染的重要防御系统,但目前关于PM2.5对巨噬细胞吞噬Mtb的影响的研究甚少,本文旨在探讨PM2.5对巨噬细胞免疫功能及吞噬Mtb能力的影响。目的:探讨PM2.5对巨噬细胞功能及吞噬结核分支杆菌能力的影响方法:(1)巨噬细胞的诱导将状态较好的THP1细胞,用含10%胎牛血清的完全1640培养液调成细胞密度为5×10~5/mL,加入PMA(80ng/ml)诱导24小时后,细胞将贴壁生长,形态变大变不规则,此即为巨噬细胞。(2)结核分枝杆菌减毒株H37Ra的培育本实验所用表达红色荧光蛋白的H37Ra(H37Ra-Red)为本实验室老师构建并提供,H37Ra-Red属需氧菌、营养要求高,生长缓慢。本实验使用含10%小牛血清的苏通培养基于37℃培养箱中培养,约15天后其液面会长出红色薄膜状菌膜,约30天后菌膜变厚、形态呈皱纹状,挑取绿豆状大小菌膜于PBS中进行研磨后接种于7H11固体斜面培养基上,接种时接种环在斜面上呈蛇形状涂抹,于37℃培养箱中培养30天左右,菌落呈菜花状生长。(3)PM2.5悬液的制备将来自中国北京地区、美国巴尔的摩地区的PM2.5制成浓度为2mg/ml、4mg/ml的PBS悬液,置于4℃避光保存,一周内用完。(4)TLR4的检测两个地区0、50、200ug/ml的PM2.5刺激巨噬细胞12、24小时后,流式细胞术检测TLR4的表达。(5)活性氧(ROS)的检测两个地区0、50、200ug/ml的PM2.5刺激巨噬细胞12、24小时后,分别以荧光显微镜及流式细胞仪检测ROS的产生情况。(6)细胞凋亡率的检测两个地区0、50、200ug/ml的PM2.5刺激巨噬细胞12、24小时后,用PI/Annexin V-FITC进行染色,用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。(7)巨噬细胞吞噬H37Ra-Red的吞噬能力检测两个地区0、50、200ug/ml的PM2.5刺激巨噬细胞12、24后,按1:10的细胞与细菌比列加入H37Ra-Red,37℃培养箱孵育12小时后,荧光显微镜观察巨噬细胞吞噬H37Ra-Red的情况。(8)Nrf2、TLR4、IL12P35、IL12P40的检测0、50、200ug/ml的PM2.5刺激巨噬细胞12、24小时后,运用荧光定量PCR技术检测TLR4、IL12P35、IL12P40、Nrf2基因的表达情况,Western-blot技术检测Nrf2蛋白水平的表达情况。结果:(1)两个地区不同浓度PM2.5刺激巨噬细胞12小时后,ROS的产生水平随PM2.5的浓度升高呈现剂量依赖性增加,而24小时后ROS的产生则随着PM2.5的浓度升高呈现先增高后降低趋势(P<0.05)。(2)两个地区不同浓度PM2.5刺激巨噬细胞12、24小时后,TLR4的产生均表现为随PM2.5浓度的升高先增高后降低的趋势(P<0.05)。(3)两个地区不同浓度PM2.5刺激巨噬细胞12、24小时后,细胞总凋亡率均随PM2.5浓度升高而增加(P<0.05)。(4)两个地区不同浓度PM2.5刺激巨噬细胞12、24小时后,细胞吞噬H37Ra-Red的能力随PM2.5浓度的升高表现为先增强后降低的趋势而24小时后,两个地区高浓度组巨噬细胞吞噬能力均低于阴性对照组(P<0.05)。(5)荧光定量PCR检测结果:两个地区不同浓度PM2.5干扰巨噬细胞12小时后,IL12的表达为随PM2.5的浓度增高呈现剂量依赖性增高、北京地区Nrf2的表达为随PM2.5的浓度增高呈现剂量依赖性增高,巴尔的摩地区Nrf2的表达均较阴性对照组表达降低、TLR4的表达则为随PM2.5浓度增高先增高后降低,24小时后,Nrf2、IL12的表达为随PM2.5的浓度增高先增高后降低、TLR4的表达较阴性对照组表达降低。(6)Western-blot检测结果显示北京地区不同浓度PM2.5刺激巨噬细胞12小时后Nrf2的表达水平上调,且呈剂量依赖性升高,但在刺激24小时后未能检测到Nrf2蛋白的表达,巴尔的摩地区PM2.5干扰巨噬细胞12、24小时后均未检测到Nrf2的表达。结论:(1)低浓度PM2.5会激发巨噬细胞的免疫功能,促进巨噬细胞吞噬结核杆菌;(2)高浓度PM2.5通过损伤细胞功能和诱导凋亡,降低巨噬细胞吞噬结核杆菌的能力。