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背景:下咽鳞状细胞癌（hypopharyngeal squamous cell carcinoma,HSCC）约占所有头颈部鳞状细胞癌病例的3%～5%。由于此病早期缺乏典型的临床症状,出现症状后就诊的下咽癌患者中,超过70%的患者已经处于Ⅲ期和Ⅳ期。下咽鳞癌侵袭性强,疾病的早期就容易发生粘膜下扩散,颈部淋巴结转移风险很高。下咽鳞癌预后比较差,由于解剖位置的特殊性治疗较具挑战性。近些年来下咽癌的治疗随着医疗技术的发展取得了一定的进步。然而,下咽鳞癌的5年总生存率只有大约15%～45%,并且在过去几十年中没有明显改善。因此,迫切需要进一步研究HSCC发生发展的分子机制,寻找新的有效治疗靶点。细胞分裂周期相关蛋白3（CDCA3）被认为是进入有丝分裂的“触发器”,并已被报道介导细胞周期进程。人类CDCA3位于染色体12p12上,由268个氨基酸组成,分子量为29kDa。CDCA3含有一个F-box基序,可与Skp1和Cullin结合,通过刺激某些蛋白质如细胞周期调节蛋白、转录因子和信号转导分子的降解来调节人体内的许多生理和病理过程。很多证据表明CDCA3在包括食管癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、口腔鳞状细胞癌、非小细胞肺癌和前列腺癌细胞中表达增加,可能与恶性肿瘤发生、发展有关。然而目前,CDCA3在下咽鳞状细胞癌中的表达及作用机制国内外均未见报道,本课题首次研究了CDCA3在下咽鳞癌中表达及意义。本课题从以下几个方面进行研究:首先通过检测临床下咽鳞癌患者的癌和癌旁正常组织中CDCA3的表达,分析CDCA3的表达水平与下咽鳞状细胞癌患者的临床病理特征及预后的关系;然后构建了shCDCA3转染的FaDu细胞株,在细胞实验中研究其对细胞功能表型的影响;最后通过二代测序技术及生物信息学技术分析、探讨CDCA3调节的分子通路,以使下咽鳞癌新的抗癌疗法的开发成为可能。第一部分 CDCA3在下咽鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义目的:检测下咽鳞癌及癌旁正常组织中CDCA3的表达,分析其表达水平与下咽鳞癌患者临床病理特征及预后的关系。方法:1.首先应用qRT-PCR技术及Western blot技术检测下咽鳞状细胞癌及癌旁正常组织中CDCA3的mRNA及蛋白的表达情况,然后对80例下咽鳞癌患者组织切片行免疫组织化学检测CDCA3蛋白的表达情况。2.分析CDCA3表达情况与下咽鳞癌患者临床病理特征的关系,采用Kaplan-Meier生存曲线分析,来评估CDCA3表达情况与下咽鳞癌患者预后的相关性。运用Cox比例风险回归模型分析影响下咽鳞癌患者总生存的预后因素。结果:1.qRT-PCR、Western blot及免疫组化结果显示下咽鳞癌组织中CDCA3的mRNA及蛋白相对表达水平较癌旁正常粘膜表达水平升高（P＜0.05）。2.CDCA3的蛋白表达与肿瘤T分期、淋巴结转移及肿瘤的TNM分期等临床病理特征相关（P＜0.05）。3.Kaplan-Meier生存曲线分析显示CDCA3阳性表达组患者的总生存期显著低于CDCA3阴性表达组（P＜0.05）。4.Cox比例风险回归模型分析显示CDCA3阳性表达是影响下咽鳞癌患者总生存的危险因素（P＜0.05）。第二部分 体外敲减CDCA3基因后对下咽鳞癌细胞生物学功能的影响目的:检测下咽鳞癌FaDu细胞株中CDCA3的表达,通过构建慢病毒沉默下的CDCA3稳转下咽鳞癌细胞系,在体外实验中研究其对细胞增殖、凋亡及细胞迁移、侵袭等表型的影响。方法:1.应用qRT-PCR技术检测下咽鳞癌FaDu细胞株及口腔鳞癌HSC-4细胞株中CDCA3的表达情况。构建慢病毒沉默下的CDCA3稳转下咽鳞癌细胞株,在体外实验中研究敲减CDCA3之后对细胞增殖、凋亡、细胞迁移及侵袭等表型的影响。2.构建慢病毒沉默下的CDCA3稳转下咽鳞癌细胞株。3.应用qRT-PCR法和Western blot方法检测敲减前后两组细胞中CDCA3转录水平和蛋白表达水平变化,验证CDCA3敲减的效率。4.应用Celigo细胞计数法、MTT法检测敲减CDCA3之后对细胞增殖能力的影响。5.应用流式细胞仪检测敲减CDCA3前后下咽鳞癌细胞的凋亡及细胞周期的变化情况。6.Transwell实验检测敲减CDCA3前后FaDu细胞迁移及侵袭能力的变化。结果:1.qRT-PCR检测结果发现FaDu细胞系中CDCA3基因表达丰度为高。2.qRT-PCR及Westen blot检测结果发现shCDCA3 组较shCtrl对照组CDCA3基因在mRNA水平及蛋白水平显著降低（P＜0.05）。3.Celigo实验及MTT实验发现shCDCA3组较shCtrl对照组细胞增殖能力明显减弱（P＜0.05）。4.流式细胞仪检测结果发现shCDCA3组较shCtrl对照组细胞凋亡率升高（P＜0.05）,并出现细胞周期阻滞（P＜0.05）。5.Transwell实验发现shCDCA3组较shCtrl对照组细胞的迁移及侵袭能力明显减弱（P＜0.05）。第三部分 CDCA3在下咽鳞癌中的分子生物学机制目的:应用二代测序技术对CDCA3敲减前及敲减之后转录组进行测序,并通过生物信息学技术探讨CDCA3在HSCC发生发展中的分子生物学机制。方法:1.应用二代测序技术对CDCA3敲减前及敲减之后转录组进行测序,并通过生物信息学技术寻找差异表达基因,对差异表达基因进行GO和KEGG通路富集分析,探讨CDCA3表达对下咽鳞癌细胞生物学特性影响的分子生物学机制。2.应用Western blot技术验证发生变化的信号通路。结果:1.生物信息学技术分析发现CDCA3敲减之后引起AKT/mTOR信号通路的变化。2.Western blot技术发现CDCA3敲减之后AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达降低。全文结论:1.CDCA3在下咽鳞癌肿瘤组织及细胞中表达上调,CDCA3的阳性表达与肿瘤T分期、肿瘤的TNM分期、颈部的淋巴结转移情况及预后显著相关。CDCA3的阳性表达是影响患者预后的危险因素。2.CDCA3敲减之后FaDu细胞增殖能力、迁移及侵袭能力明显减弱,CDCA3基因下调抑制增殖可能与细胞周期阻滞及细胞凋亡增加有关。3.CDCA3可能通过AKT/mTOR信号通路促进下咽鳞癌的发生及发展。