【摘 要】
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L乳酸在食品工业、医药、农牧业、化妆品、化工等领域有十分广泛的应用,L乳酸的高分子聚合物聚L乳酸（PLLA）是FDA批准的生物材料,可被自然界的微生物完全降解形成二氧化碳和水,作为高污染石油化工原料的替代品生产塑料已成为全球学者的研究热点。随着环境问题的彰显和自然资源的短缺,L乳酸的市场需求量持续上升。微生物发酵法能生产光学纯度高的L乳酸,原料来源广,现已成为L乳酸工业化生产的主要方法。现阶段,国
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L乳酸在食品工业、医药、农牧业、化妆品、化工等领域有十分广泛的应用,L乳酸的高分子聚合物聚L乳酸（PLLA）是FDA批准的生物材料,可被自然界的微生物完全降解形成二氧化碳和水,作为高污染石油化工原料的替代品生产塑料已成为全球学者的研究热点。随着环境问题的彰显和自然资源的短缺,L乳酸的市场需求量持续上升。微生物发酵法能生产光学纯度高的L乳酸,原料来源广,现已成为L乳酸工业化生产的主要方法。现阶段,国内高品质的L乳酸主要依赖进口,研发高纯度的L乳酸生产菌株对于扩大工业化生产具有重要意义。同型发酵的乳酸菌作为工业化生产L乳酸的常用菌株具有耐酸性差的弊端,研究如何改造耐酸性强、鲁棒性好的酿酒酵母生产L乳酸已引起了科学家的广泛关注。为减弱酿酒酵母的Crabtree效应,本实验利用CRISPR/Cas9系统敲除了编码丙酮酸脱羧酶的基因pdc1和编码乙醇脱氢酶的基因adh1以减少乙醇的生成,在此基础上分别采用质粒表达和整合表达的方式引入外源编码L乳酸脱氢酶的基因lldh。利用Ty4转座子位点,将lldh整合到染色体上,获得基因多拷贝表达且可稳定遗传的工程菌。利用酶标仪法检测工程菌和野生菌的生长,用DNS法检测发酵液中的残糖,利用高效液相色谱法检测工程菌和野生菌L乳酸合成情况,结果如下:1、构建了pdc1和adh1基因的打靶质粒,利用CRISPR/Cas9系统敲除了Saccharomyces cerevisiae 288C的pdc1基因和adh1基因,经过选择性培养基的筛选和菌液PCR验证得到了pdc1和adh1缺失的工程菌SC/?pdc1?adh1。将SC/?pdc1?adh1与野生菌WT共同进行摇瓶培养发现:SC/?pdc1?adh1在厌氧培养过程中几乎不生长;在好氧培养过程中,SC/?pdc1?adh1前24 h生长速度明显比WT慢,在培养60 h后达到的最大菌体浓度比WT略低。2、构建了lldh表达质粒,将该质粒转入SC/?pdc1?adh1和WT中,通过筛选和PCR验证得到工程菌lldh/?pdc1?adh1和lldh/WT。通过摇瓶发酵发现:与出发菌株SC/?pdc1?adh1相比,lldh/?pdc1?adh1的生长速度较快,lldh/WT的生长速度最快。经测定48h后发酵液葡萄糖基本消耗完毕,此时视为发酵终点,用SBA-40D生物传感分析仪测定发酵终点的L乳酸合成状况,实验结果表明:SC/?pdc1?adh1没有乳酸积累,lldh/WT可积累1.0 g/L L乳酸,lldh/?pdc1?adh1可积累1.5 g/L L乳酸,实现了从无到有的过程,lldh/?pdc1?adh1的产酸量与lldh/WT相比提高了50%,说明敲除了pdc1和adh1基因后在一定程度上减少了由丙酮酸合成乙醇的支流代谢流,强化了L乳酸的生物合成。3、利用CRISPR/Cas9系统将lldh基因表达盒整合到了SC/?pdc1?adh1和WT基因组的Ty4位点上,经过筛选和分子验证得到了工程菌lldh-Ty4/?pdc1?adh1和lldh-TY4/WT,实现了lldh基因多拷贝染色体整合表达。随后将lldh-Ty4/?pdc1?adh1进行了适应性进化传代培养,将第九代菌株进行摇瓶发酵。通过OD600的测定发现工程菌与WT生长状况基本一致,将48 h后的发酵液进行HPLC检测,发现WT没有L乳酸积累,lldh-Ty4/WT乳酸积累量为17.14g/L,乳酸对葡萄糖的产率系数为0.34g/g,而lldh-Ty4/?pdc1?adh1 L乳酸积累量为23.4 g/L,产率系数为0.468 g/g,产量上比lldh-Ty4/WT提高了约37%,最终实现了构建生物合成L-乳酸的工程菌的目标。目前,国内还没利用CRISPR/Cas9技术和酿酒酵母Ty4多拷贝系统来实现L乳酸脱氢酶异源高效表达的报道,因此本研究具有理论价值和应用价值。
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