【摘 要】
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研究目的中药饮片作为中医临床用药,其市场需求日趋庞大,已占据中药产业支柱地位。中药饮片一旦出现安全性问题,“治病药”即刻变成“致病药”,严重危害国民健康。虽然国家GMP、2020版《中国药典》和地方生产规范等标准更加严格,但中药饮片病原菌污染的情况仍时有发生,且难以彻底清除。现有中药饮片病原菌的检测依赖培养分离鉴定的金标准方法或PCR核酸扩增的常规通用方法,不同程度存在检测耗时长、依赖实验室或大型
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研究目的中药饮片作为中医临床用药,其市场需求日趋庞大,已占据中药产业支柱地位。中药饮片一旦出现安全性问题,“治病药”即刻变成“致病药”,严重危害国民健康。虽然国家GMP、2020版《中国药典》和地方生产规范等标准更加严格,但中药饮片病原菌污染的情况仍时有发生,且难以彻底清除。现有中药饮片病原菌的检测依赖培养分离鉴定的金标准方法或PCR核酸扩增的常规通用方法,不同程度存在检测耗时长、依赖实验室或大型设备、检测成本高、检测靶标数少等问题,难以满足中药饮片病原菌的现场化、低成本、快速检测要求。环介导等温扩增（LAMP）技术不依赖温度循环模块、检测灵敏度高、扩增耗时短,对抑制剂耐受性好,是可替代PCR的核酸扩增方法。基于此,采用微流控芯片搭载LAMP技术可具备过程自动化、低成本、高效率等优势。截止目前,尚无对中药饮片病原菌的微流控LAMP技术的检测方法开发及其实际应用。本研究旨在构建微流控LAMP技术平台,旨在开发一种快速检测技术,实现对中药饮片致病微生物简单、快速、准确、灵敏和多靶标检测。研究方法1.针对4种中药饮片常见致病菌（沙门氏菌属、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌属）,查阅相关文献并进行生物信息学分析,靶向性挖掘细菌特异毒力基因序列,根据毒力基因设计、筛选、验证4种致病菌LAMP引物组。2.建立LAMP反应体系,并摸索优化温度、扩增时间、各组分浓度等条件,获得LAMP检测体系的最优条件。3.选择与靶标细菌亲缘关系远近各异的细菌作为阴性对照,对所筛选引物进行特异性测试,进一步获得选择性良好的LAMP引物组。4.基于最优检测条件,分别以致病菌基因组和靶基因质粒作为模板,验证筛选引物组的扩增效率及检测限。5.以金黄色葡萄糖球菌为例,比较PCR和LAMP在检出限、响应时间等方面的差异,明确LAMP检测技术的优势。6.设计制作10通道的微流控芯片,将LAMP反应体系搭载至微流控芯片,测试微流控LAMP检测体系的特异性、灵敏度、检出限等特性,验证该检测体系的可行性。7.设置复杂基质的生物样品,分别将不同细菌掺入牛奶、苹果、酸奶、猪肉等不同基质,在微流控LAMP检测体系检验回收率及抗干扰性能。8.模拟中药饮片细菌污染样品,分析该检测体系对枸杞子、甘草、生地黄、川牛膝等中药饮片中病原菌污染检测的选择性、检出限。研究结果1.针对沙门菌靶基因sir A筛选了4组引物、筛选了6组金黄色葡萄球菌靶基因sp A引物,筛选了4组引物靶向志贺菌毒力基因ipa H、根据株水平特异性fli C基因筛选了2组出血性大肠杆菌引物。2.优化了LAMP反应体系,确定最佳反应温度为65°C、最佳Mg2+浓度为6 m M、最佳甜菜碱浓度为0.6 M。3.针对4种致病菌毒力基因,每个基因至少筛选出了1种以上特异性LAMP引物组,最优反应条件下最短20 min可检出目标基因。4.检测限实验证明,所设计引物对致病细菌基因组检测限低至10~3CFU/m L,质粒检测限最低10~2 copies/反应。5.在相同检测时间（45 min）内,对比PCR和LAMP反应产物电泳条带,证明了LAMP比PCR检测限低一个数量级。6.搭载微流控芯片LAMP技术体系,验证了该技术体系对4种致病菌的基因组DNA及靶基因质粒的特异性及检测限,证明微流控LAMP检测系统可行性。7.将牛奶、苹果、酸奶、猪肉等样品掺杂金黄色葡萄球菌、志贺菌作为模拟样品,经简单DNA提取方法,所得待检测样品在微流控LAMP检测体系上测试,其回收率在86.1%–110%,RSD＜9%,证明该技术抗干扰能力强。8.在模拟饮片实验进一步证明,该技术体系可特异性测出4种致病菌,检测限低至50–100 CFU/g,与单菌落测试结果相似,证明该检测体系对真实饮片样品的检测可行性。研究结论1.本研究获得了靶向范围适中的LAMP引物组,可用于多靶标致病菌检测。2.本微流控LAMP技术特异性好,可用于复杂基质样品中病原菌检测。反应结果可用可见光和荧光双重信号,可摆脱荧光检测设备的依赖。3.初步证明了通过LAMP技术检测中药饮片病原菌可行性,为其搭载至芯片提供了研究基础。4.本研究开发的微流控LAMP技术检测耗时短、检出限低、靶标数多、自动化程度高,有望用于现场化快速中药饮片细菌污染检测,具有广泛的应用潜力。为中药饮片病原菌现场可视化快速检测提供了坚实前期研究。
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