天然产物活性成分往往含量很低,现有天然产物筛选方法对于微量活性成分的发现效率有限。磁珠固定化酶具有稳定性强、重复性好、易于分离等特点,已广泛应用于天然产物的活性成分筛选。结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶（Mycobacterium tuberculosis isocitrate lyase,Mt ICL）是休眠结核菌乙醛酸循环必须酶,是清除休眠结核菌关键靶之一。本课题组前期建立的基于磁珠固定靶蛋白迭代筛选（Affinity Driven Exponential Enrichment,ADEE）方法,及快速分批结合预富集偶联迭代筛选（Affinity Driven Pre-enrichment and Exponential Enrichment,ADPEE）,初步证明可应用于组合合成小库的高亲和力配体发现。本文基于多种磁珠固定靶蛋白,优化ADPEE,并应用于探索天然产物中以Mt ICL靶为主的未知高亲和力配体的富集和发现。重组表达N端6×His标签的Mt ICL,并选用MSP-COOH-F1和MSP-NTA两种表面修饰偶极离子的亲水磁珠固定化Mt ICL并考察两种磁珠的固定化容量、保留酶活和稳定性等。优选羧基磁珠并优化固定化体系用于后续筛选工作。利用Discovery Studio（DS）2019虚拟筛选,发现结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶（Mt DHFR）、Mt ICL的新型有效抑制剂。以Mt DHFR与甲氨蝶呤复合物晶体（PDB:1DF7）、Mt ICL与三溴丙酮酸复合物晶体（PDB:1F8M）提取靶蛋白结构和活性中心,用于天然产物库SELLECK和TCMSP筛选。通过对接、打分、相互作用力分析以及ADMET计算,获得苗头化合物结构。经活性验证,S5145（Protoporphyrin,原卟啉）对Mt DHFR的IC50为0.29±0.24μmol/L（n=3）,抗M.smegmatis的MIC值为175.8μg/m L;MOL005118（Daphetin,瑞香素）对Mt ICL的IC50为4.43±0.37μg/m L（≈24.38±0.37μmol/L,n=3）,抗M.smegmatis的MIC值为128μg/m L。原卟啉、瑞香素分别来自鸡蛋壳（褐色素）和祖师麻,后续可选用这两种天然产物进行ADPEE筛选验证。ADPEE是重复快速结合并分离的预富集偶联迭代筛选方法。理论推测其预富集过程为动力学控制过程,故设计以结合时间为变量的实验考察ADPEE预富集可能机制。结果显示,快速结合时间越短,预富集选择性越高,高亲和力配体预富集绝对量更高,初步说明此过程为动力学非平衡结合过程;相较于ADEE,在3 min快速结合预富集条件下,ADPEE筛选目标配体相对于参考配体的累积富集效率比明显优于ADEE累积富集效率比;筛选体积较小且蛋白损耗量相对较低,操作更简便,但绝对富集量相对于ADEE有所降低。可见相对于ADEE,ADPEE选择性更高。因此,ADPEE富集混合物中微量高亲和力配体的综合效能更高,对天然产物中微量活性成分的筛选ADPEE将具有更强实用性。应用ADPEE,探索不同靶蛋白的天然产物筛选。针对Mt DHFR,经中药提取物活性初筛,选择北沙参、生地黄和熟地黄用ADPEE筛选,被富集成分未在数据库中搜索到相应分子量目标结构,有待纯化分离后鉴定;针对Mt ICL,选择祖师麻制备醇提物,瑞香素经ADPEE有效富集。综上所述,通过比较两种不同亲水磁珠对靶蛋白Mt ICL的固定化方案,MSP-COOH-F1对靶蛋白的固定化效果最优;虚拟筛选首次发现Mt ICL潜在高亲和力抑制剂瑞香素;通过实验设计进一步明确ADPEE预富集的动力学控制过程;以Mt DHFR为靶蛋白,通过实验比较发现ADPEE相对富集效率是ADEE的～1.3倍,明确ADPEE可能是天然产物的筛选的更实用方案。