基于Nogo-A/NgR通路研究针药结合对MCAO大鼠脑白质损伤的作用及机制

来源 :皖南医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liujitao0811
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目的:脑卒中的损伤机制复杂,目前的研究主要集中在灰质,而对白质的研究甚少。缺血性卒中通常会引起严重的白质病变,现阶段缺乏针药结合干预促进白质轴突可塑性和神经功能恢复的效应机制研究。通过实验观察脑缺血后大鼠脑缺血灶及周围脑白质内的Nogo-A和Ng R蛋白表达情况,来探讨电针、天麻素单独或联合治疗对脑缺血后轴突再生的影响,进而探究电针及天麻素是否通过调节Nogo-A/Ng R信号通路减轻脑缺血大鼠脑白质损伤和促进轴突再生,为中医药治疗脑血管疾病的临床应用提供理论与实验依据。方法:1.70只成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机分为正常组(Normal组)、假手术组(Sham组)、MCAO模型组(Model组)、电针组(EA组)、天麻素组(Gas组)、电针结合天麻素组(EA+Gas组)以及NEP1-40组(NEP组),每组10只。采用大脑中动脉栓塞法(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)复制局灶性脑缺血大鼠模型。EA组予以电针针刺“百会”、左侧“足三里”穴,1次/天,每次30min,连续14天;Gas组腹腔注射天麻素注射液(10 mg/kg),1次/天,连续14天;EA+Gas组先腹腔注射天麻素注射液10 mg/kg,再给予电针针刺“百会”穴与左侧“足三里”穴30 min,1次/天,治疗周期为14天;NEP组用微量进样器将5μl剂量的NEP1-40(10μg/μL)注入右侧侧脑室,连续3天。2.在造模术后2 h及第1天、3天、7天、14天采用Zea Longa神经功能缺损评分法评估大鼠神经功能缺损及恢复情况;在造模术后3天、7天、14天采用胶带去除实验观测脑缺血大鼠的接触胶带时间、去除胶带时间,进一步进行感觉和运动功能评价。3.苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察胼胝体和内囊区髓鞘的病理学改变;神经髓鞘固蓝(Luxol fast blue,LFB)染色观察胼胝体和内囊区髓鞘的完整情况;免疫组织化学染色法检测MBP、Nogo-A和Ng R在胼胝体和内囊中的定位表达情况;蛋白免疫印迹法(Western blot,Wb)检测胼胝体和内囊中MBP、Nogo-A和Ng R相对表达量。所有实验数据用SPSS 18.0软件创建数据库,并进行统计学分析。结果:1.各组大鼠不同时间点的神经功能缺损评分结果显示:脑缺血造模术后2 h及第1天、3天、7天、14天进行神经功能缺损评分,Sham组中未出现神经功能缺损表现;与Sham组比较,Model组大鼠神经功能缺损评分提高(P<0.05);与Model组比较,随治疗时间的延长,EA组、Gas组、EA+Gas组和NEP组大鼠在脑缺血第3天、7天、14天时神经功能缺损评分逐渐降低(P<0.05);与EA组、Gas组比较,EA+Gas组在第7天、14天神经功能评分明显降低(P<0.05)。2.各组大鼠不同时间点的胶带去除实验结果显示:与Sham组比较,Model组接触胶带和去除胶带所需时间明显延长(P<0.05);与Model组比较,EA组、Gas组、EA+Gas组接触时间在第3天、7天差异有统计学意义(P<0.05),NEP组接触时间在第7天差异有统计学意义(P<0.05);与Model组比较,EA组、Gas组、EA+Gas组、NEP组去除时间在第7天、14天差异有统计学意义(P<0.05);与EA组、Gas组比较,EA+Gas组在第7天接触时间有所缩短(P<0.05),EA+Gas组在第7天、14天去除时间有所缩短(P<0.05)。3.HE和LFB染色结果显示:与Sham组比较,Model组缺血侧胼胝体和内囊区纤维排列紊乱,有大量髓鞘丢失(P<0.01);与Model组比较,EA组、Gas组、EA+Gas组以及NEP组囊泡面积减少(P<0.01),髓鞘LFB染色平均光密度值明显增高(P<0.05);与EA组、Gas组比较,EA+Gas组胼胝体和内囊白质纤维束间囊泡面积减少(P<0.05),髓鞘LFB染色平均光密度值增高(P<0.05)。4.免疫组织化学染色结果显示:与Sham组比较,Model组MBP染色平均光密度值降低(P<0.05),Nogo-A和Ng R染色平均光密度值升高(P<0.05);与Model组比较,EA组、Gas组、EA+Gas组和NEP组MBP染色平均光密度值升高(P<0.05),Nogo-A和Ng R染色平均光密度值降低(P<0.05);与EA组、Gas组比较,EA+Gas组MBP平均光密度值升高(P<0.05),Nogo-A和Ng R平均光密度值降低(P<0.05)。5.Western blot结果显示:与Sham组比较,Model组MBP表达水平下降(P<0.05),Nogo-A和Ng R表达水平升高(P<0.05);与Model组比较,EA组、Gas组、EA+Gas组和NEP组MBP表达水平上调(P<0.05),Nogo-A和Ng R表达水平下调(P<0.05);与EA组、Gas组比较,EA+Gas组MBP表达水平升高(P<0.05),Nogo-A和Ng R表达水平降低(P<0.05)。结论:1.电针、天麻素单独或联合治疗脑缺血损伤大鼠,均可改善脑缺血大鼠神经功能缺损评分,改善脑缺血大鼠运动和感觉功能,促进神经功能恢复,其中,联合治疗的效应优于单独治疗组。2.电针、天麻素单独或联合治疗脑缺血损伤大鼠,可促进脑缺血后胼胝体、内囊部位髓鞘的恢复与重建,减轻白质损伤,以联合治疗效应为佳。3.运用电针、天麻素单独或联合治疗脑缺血损伤大鼠,均可上调缺血脑组织中MBP表达,下调缺血脑组织中Nogo-A/Ng R表达,从而促进髓鞘恢复,减轻轴突损伤,针药结合的治疗效应优于单独治疗,这可能是针药结合改善脑缺血大鼠神经功能的机制之一。
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