【摘 要】
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目的:目前在某些神经退行性疾病和创伤性脑损伤研究中发现星形胶质细胞丰富极化为A1型星形胶质细胞并导致大量神经元凋亡。然而,关于弓形虫感染是否诱导星形胶质细胞极化为A1型以及A1型星形胶质细胞在弓形虫脑炎（TE）神经元死亡中的作用机制尚不清楚。本研究通过构建弓形虫TgCtwh6株慢性感染小鼠模型分别检测不同时间段活化的小胶质细胞与星形胶质细胞标志蛋白及相关炎性因子的基因转录和表达水平等,评估A1型星
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目的:目前在某些神经退行性疾病和创伤性脑损伤研究中发现星形胶质细胞丰富极化为A1型星形胶质细胞并导致大量神经元凋亡。然而,关于弓形虫感染是否诱导星形胶质细胞极化为A1型以及A1型星形胶质细胞在弓形虫脑炎（TE）神经元死亡中的作用机制尚不清楚。本研究通过构建弓形虫TgCtwh6株慢性感染小鼠模型分别检测不同时间段活化的小胶质细胞与星形胶质细胞标志蛋白及相关炎性因子的基因转录和表达水平等,评估A1型星形胶质细胞在神经细胞死亡中的作用,初步探讨TE发病的潜在分子机制,为寻找治疗慢性TE提供实验依据。方法:构建TgCtwh6株慢性感染的小鼠模型,随机分为四组:对照组（CK组）和TgCtwh6感染组1月组（1 month）、3月组（3 month）、6月组（6 month）。感染相应时间后对小鼠进行体表形态的观察和脑组织石蜡切片HE染色,以观察小鼠体态行为的改变和确定慢性感染的形成。随后将实验小鼠安乐死,收集脑组织,利用q RT-PCR方法检测小鼠脑组织GFAP、C3、C1q、IL-1α和TNF-α基因的转录水平,利用ELISA、Western blotting等方法检测其表达水平;取小鼠脑组织石蜡切片染色,间接免疫荧光染色,用激光共聚焦显微镜观察,确定活化的小胶质细胞和A1型星形胶质细胞的数量、位置关系,计算GFAP+C3+细胞/GFAP+细胞×100%比率。结果:（1）与对照组小鼠相比,弓形虫感染组小鼠出现食欲不振、弓背、毛发竖立、活动量减少和精神萎靡等情况,并且随着时间表现加重。HE染色镜下观察感染组有完整囊壁的圆形包囊,内含大量缓殖子,提示弓形虫慢性感染小鼠建模成功。（2）A1型星形胶质细胞标志蛋白C3的转录和表达水平变化:总体呈现上升-下降-上升趋势,均为CK组表达量最低。弓形虫感染一个月时,C3的转录和表达水平上升。弓形虫感染三个月时呈短暂回落,弓形虫感染六个月时,该水平又上调。提示在弓形虫感染1个月时,此时炎症较为强烈,可能存在A1型星形胶质细胞极化现象,且这种极化程度随着病程的进展而不断变化。星形胶质细胞标志蛋白GFAP的转录和表达水平:总体也呈现上升-下降-上升的同步趋势,均为CK组表达量最低。小胶质细胞标志蛋白IBA1的转录水平:总体也呈现上升-下降-上升的同步趋势,提示星形胶质细胞向A1型星形胶质细胞极化过程中可能伴随小胶质细胞同步活化。（3）炎症因子C1q、IL-1α和TNF-α的转录和表达水平变化:总体呈现上升-下降-上升趋势,均为CK组表达量最低。弓形虫感染一个月时,C1q、IL-1α、TNF-α转录水平均有所上升。弓形虫感染三个月时,均短暂回落。弓形虫感染六个月时,三种炎症因子均又迎来上调;各组C1q蛋白水平检测中,CK组表达量最低,感染三月组的表达量最高;各组IL-1α蛋白水平检测中,CK组表达量最高,感染六月组的表达量最低;各组TNF-α蛋白水平检测中,CK组表达量最高,感染三月组的表达量最低。提示星形胶质细胞向A1型星形胶质细胞极化过程中可能伴随三种炎症因子同步变化。（4）免疫荧光法检测显示弓形虫慢性感染小鼠脑组织海马和皮层两部位确实均存在大量活化的小胶质细胞和A1型星形胶质细胞。在TE小鼠中,A1型星形胶质细胞（GFAP+C3+）在星形胶质细胞（GFAP+）的比例明显高于对照组。在小鼠脑组织海马部位,1月组中A1型星形胶质细胞占比最高;在小鼠脑组织皮层部位,1月组中A1型星形胶质细胞占比最高;这与q RT-PCR、WB的结果基本一致。且皮层部位中A1型星形胶质细胞的比例高于海马部位A1型星形胶质细胞的比例,这与包囊多出现在皮层部位相吻合。结论:弓形虫TgCtwh6株感染小鼠过程中存在星形胶质细胞极化为A1型星形胶质细胞现象;TE的形成可能是和A1型星形胶质细胞释放神经毒性物质有关。
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