论文部分内容阅读
目的:基于肺泡Ⅱ型上皮(AT2)细胞具有增殖、分化为Ⅰ型上皮以及免疫调节等多种功能,研究自体成纤维细胞通过细胞直接重编程转化的诱导AT2细胞(ciAT2)对急性肺损伤小鼠的保护作用。通过研究ciAT2的生物学行为和移植后对急性肺损伤肺组织的保护作用,为急性肺损伤的细胞移植治疗提供实验依据。第一部分 ciAT2细胞的获得和鉴定方法:将小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)用转分化化学小分子组合(SMC)处理14天,获得MEF转分化的诱导AT2细胞(ciAT2)。用MEF作为阴性对照,eAT2为阳性对照,对ciAT2的细胞特征进行鉴定。实验方法:用细胞形态,AT2细胞的特殊标志物(SPC)的免疫荧光染色,以及细胞SPC蛋白含量检测,和AT2细胞的特殊细胞器(层状体)电镜检测等方法,鉴定ciAT2细胞的细胞学特征。结果:ciAT2组具有eAT2相似形态和特征:细胞形态为类圆形,免疫荧光染色发现SPC(AT2细胞独有)强阳性表达,电镜扫描发现细胞有层状体结构(AT2细胞独有),直径约为0.6μm;用Western blot实验,发现SPC蛋白在ciAT2中高表达。这些结果表明ciAT2细胞具eAT2细胞相似形态特征。第二部分内毒素制备急性肺损伤小鼠动物模型方法:40只C57的雄性小鼠,随机分成4组。分别为对照组和急性肺损伤后不同时间观察组(24h、48h、72h)。实验方法:采取气管内滴注内毒素LPS(2mg/kg)联合滴注后直立匀速摇摆(30S)的方法制备急性肺损伤模型,分别于造模后24h、48h、72h观察急性肺损伤相关指标改变,包括炎性相关指标如肺泡灌洗液的炎性因子水平、肺组织中的炎性因子mRNA表达等,并且通过病理切片检测模型小鼠三个时间点的肺泡和肺组织结构受损情况。结果:与正常对照组小鼠比较,急性肺损伤小鼠在造模24h、48h、72h后均表现出明显的精神倦怠,懒动。肺泡灌洗液中炎性因子的水平明显增加,抗炎因子的水平显著减少;其中,炎性因子IL-6和TNF-a的水平在48h达到高峰。肺组织中中的炎性基因的mRNA表达显著提升,抗炎因子的mRNA表达显著降低,其中炎性因子IL-1 β和TNF-a的mRNA表达水平在48h达到高峰。另外,肺组织的病理切片结果显示肺泡和肺组织结构均明显受损,24h损伤发生在气管周围,48h损伤蔓延到气管及大部分肺部,72h损伤弥漫至整肺。第三部分ciAT2细胞对急性肺损伤小鼠的保护作用方法:60只健康的C57小鼠,随机分成5组。①对照组(同体积NaCl,n=12),②LPS 组(LPS 2mg/kg,n=12),③LPS+MEF 移植组(LPS 2mg/kg,n=12),④LPS+ciAT2移植组(LPS2mg/kg,n=12),⑤LPS+eAT2移植组(n=12)。细胞移植实验组小鼠皆在气管滴注LPS或者同体积NaCl后6-8h以及第二天相同时间点(30-32h)进行细胞移植,剂量为0.3X106/只,细胞移植治疗72h后收样,检测相关指标改变。Elisa用来检测肺泡灌洗液的炎性因子相关指标变化;荧光定量PCR仪用来检测肺组织中的炎性因子mRNA表达;计算肺体比和湿干重(湿/干肺重)比值用来评价肺泡壁血管的通透性异常;HE染色对肺组织的病理改变进行评估。结果:肺泡灌洗液中的炎性指标结果表明,与正常对照小鼠相比,LPS组的炎性因子TNF-a和IL-6的含量均明显上升(P<0.001),抗炎因子IL-10和TGF-β的含量均明显下降(P<0.01,P<0.05)。与 LPS 组相比,LPS+eAT2 组和 LPS+ciAT2组的TNF-a和IL-6的含量均明显下降(P<0.001),而LPS+MEF组的TNF-a和IL-6的含量有所下降,但没有统计学意义(P>0.05)。三个组的IL-10和TGF-β的含量都有所升高,但没有统计学意义P>0.05)。肺组织中的炎性因子mRNA表达水平结果表明,与正常对照组小鼠相比,LPS组的炎性因子TNF-a和IL-1β的mRNA表达水平均明显上升(P<0.001,P<0.01),抗炎因子IL-10和TGF-β2的mRNA表达水平明显下降(P<0.001),抗炎因子TGF-β1的mRNA表达水平下降,但没有统计学差异(P>0.05)。与LPS组小鼠相比,LPS+eAT2组和LPS+ciAT2组的TNF-a和IL-1β的mRNA表达水平均明显下降(P<0.001,P<0.01),TGF-β1和TGF-β2的mRNA表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001),LPS+MEF 组的 TNF-a 和 IL-1β 的mRNA表达水平有所下降,但没有统计学意义(P>0.05),IL-10mRNA表达水平明显降低(P<0.001),TGF-β2的mRNA表达水平明显升高(P<0.05),TGF-β1的mRNA表达水平升高,但没有统计学意义(P>0.05)。肺体比和湿干重的结果表明,与正常组相比,LPS组的肺体比和湿干重比值明显升高(P<0.001),与LPS组相比,LPS+eAT2组的肺体比和湿干重明显降低(P<0.001),LPS+ciAT2组的肺体和湿干重明显降低(P<0.001),而LPS+MEF的肺体比和湿干重虽有下降,但没有统计学意义(P>0.05)。HE染色的结果表明,ciAT2组和eAT2细胞移植治疗组的肺组织损伤情况有明显改善,部分肺泡结构恢复,具正常结构肺泡数量增加。结论:本研究通过比较细胞的形态,AT2细胞的特征标志物SPC的免疫荧光染色和蛋白含量检测,以及电镜扫描发现特有的细胞器(层状体)的存在,确定了小分子药物组合诱导的MEF转分化ciAT2细胞具AT2细胞相似形态、结构并表达AT2细胞特有标志物SPC。通过气管内滴注内毒素2mg/kg,完毕后匀速摇摆30s,保证左右肺LPS的均匀分布,成功制备了急性肺损伤小鼠模型。从模后24h、48h、72h三个时间点的动态观察发现,造模后72h仍可维持急性肺损伤的病理特征。且造模后48h时是炎性指标分泌达到高峰,72h时病理特征最为明显。基于AT2细胞具增殖、可分化为Ⅰ型上皮和调节免疫功能,研究建立了急性肺损伤小鼠细胞移植治疗模型,比较eAT2细胞和ciAT2细胞对急性肺损伤的保护功效。结果发现,eAT2细胞和ciAT2细胞均可以改善急性肺损伤引起的肺水肿、降低炎性因子并提高抗炎因子的分泌,在一定程度上改善了急性炎症,修复肺损伤并保护了肺部功能。研究为急性肺损伤的细胞移植治疗提供提供了实验依据。