【摘 要】
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目的:从自噬角度探讨中药复方耳聋左慈丸对老年性聋的防治作用及其机制。方法:1.体外实验:采用H2O2建立HEI-OC1听细胞氧化损伤模型,观察耳聋左慈丸对HEI-OC1听细胞氧化损伤的干预作用及其机制。采用CCK-8法检测细胞存活率,细胞内ROS荧光检测试剂盒检测ROS水平,Western blot检测HEI-OC1听细胞自噬相关蛋白LC3-II、Beclin1和p62的表达。2.体内实验:观察耳
【基金项目】
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国家自然科学基金（81774020）；
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目的:从自噬角度探讨中药复方耳聋左慈丸对老年性聋的防治作用及其机制。方法:1.体外实验:采用H2O2建立HEI-OC1听细胞氧化损伤模型,观察耳聋左慈丸对HEI-OC1听细胞氧化损伤的干预作用及其机制。采用CCK-8法检测细胞存活率,细胞内ROS荧光检测试剂盒检测ROS水平,Western blot检测HEI-OC1听细胞自噬相关蛋白LC3-II、Beclin1和p62的表达。2.体内实验:观察耳聋左慈丸对C57BL/6J小鼠年龄性相关听力损失的干预作用及其机制。采用ABR检测C57BL/6J小鼠的听功能;HE染色法观察耳蜗的形态学的变化;试剂盒检测小鼠听皮层中MDA和T-SOD含量的变化;采用免疫荧光技术检测耳蜗切片中SOD和自噬相关蛋白的表达情况;Western blot检测小鼠听皮层自噬相关蛋白LC3-II、Beclin1和p62的表达。结果:1.体外实验:（1）H2O2可呈剂量依赖地抑制HEI-OC1细胞的生长,细胞存活率与对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.001）。6、12、18 mg/m L浓度耳聋左慈丸给药组的细胞存活率显著高于H2O2模型组,且差异有统计学意义（P＜0.001）。（2）H2O2模型组细胞内ROS的水平呈剂量依赖性地增高,与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.001）。耳聋左慈丸给药组ROS水平显著降低,与H2O2模型组比较差异具有统计学意义（P＜0.001）。（3）与对照组比较,300μM H2O2作用24 h,LC3-II蛋白和Beclin1蛋白表达显著增强,差异有统计学意义（P＜0.05）;而耳聋左慈丸给药组的LC3-II和Beclin1蛋白表达水平与模型组比较表达显著降低,差异有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）。2.体内实验:（1）ABR检测结果显示,C57BL/6J小鼠具有年龄相关性听力损失的特征。给药3个月,低（3 g/kg/d）、中（6g/kg/d）、高（12 g/kg/d）三个浓度的耳聋左慈丸组在24 KHz频率的听阈值低于老年性聋组,差异有统计学意义（P＜0.001）。给药6个月,低浓度耳聋左慈丸组在16 k Hz频率的听阈低于老年性聋组,差异有统计学意义（P＜0.001）;中、高浓度耳聋左慈丸组在16 k Hz和24 k Hz频率的听阈值显著低于老年性聋组,差异有统计学意义（P＜0.001）。采用中浓度耳聋左慈丸给药6个月进行后续实验研究。（2）HE染色结果显示,老年性聋组耳蜗底回的螺旋神经节细胞与对照组比较,数量减少,形态异常增加,可见空泡,提示螺旋神经节损伤。耳聋左慈丸给药组底回螺旋神经节细胞的病理损伤与老年性聋组比较有明显减轻。（3）免疫荧光结果显示,与对照组比较,老年性聋组耳蜗底回螺旋神经节细胞SOD表达水平降低,耳聋左慈丸组螺旋神经节细胞SOD表达与老年性聋组比较,显著增强。（4）试剂盒检测结果显示,与对照组比较,老年性聋组小鼠听皮层的MDA含量升高,与对照组比较,差异统计学意义（P＜0.01）;而耳聋左慈丸组的MDA含量与老年性聋组比较,显著降低（P＜0.05）。听皮层T-SOD含量三组之间差异无统计学意义。（5）免疫荧光结果显示,与对照组比较,老年性聋组耳蜗底回螺旋神经节细胞LC3、p62和Beclin1表达增强,耳聋左慈丸组LC3、p62和Beclin1表达强度与老年性聋组比较有所降低。（6）Western blot检测结果发现,与对照组比较,老年性聋组听皮层LC3-II、p62和Beclin1表达增高（P＜0.001,P＜0.01,P＜0.05）,耳聋左慈丸组听皮层LC3-II、p62和Beclin1蛋白表达水平相对老年性聋组有所降低（P＜0.001,P＜0.01,P＜0.05）。结论:耳聋左慈丸可以通过调节自噬,抑制氧化应激,从而达到延缓老年性聋的作用。
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