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目的:颅脑创伤（Traumatic brain injury,TBI）昏迷后及时促醒是神经科学界研究的聚焦点。手十二井穴刺络放血法（井穴刺络法）对TBI在内的多种中枢神经损伤患者的意识状态具有改善效用,但其促醒机制尚未阐明,限制该法临床应用与推广。课题组基于井穴刺络法促醒TBI后昏迷大鼠,进而发现腹侧中脑导水管周围灰质区（ventral Periaqueductal gray,vPAG）多巴胺（Dopamine,DA）表达P2RX7介导该法促醒,且该法可激活下丘脑外侧区（Lateral hypothalamus,LH）多巴胺D2受体（Dopamine receptor D2,DRD2）和食欲素（Orexin,ORX）,激活结节乳头核（Tuberomammillary nucleus,TMN）区DRD2,下调该区组胺（Histamine,HA）表达。LH和TMN区是网状上行激活系统（Ascending reticular activing system,ARAS）中的下丘脑核团,接受vPAG区DA能系统投射。因此,本研究围绕vPAG区P2RX7环路-下丘脑投射系统进一步阐释该法促醒TBI机制。方法:实验一基于脑电波监测评价井穴刺络法改善TBI大鼠意识水平的效应研究成年健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠随机分3组（n=6）:假手术（Sham）、模型（TBI）、模型+井穴刺络法（Hand Acu）。Sham组仅开颅窗;TBI组制备重型TBI模型;Hand Acu组在成功造模的基础上即予以井穴刺络法。采集大鼠脑电波（electroencephalogram,EEG）图像。效应指标为昏迷时长、六级意识评分（TBI后3 h、4 h、5 h、6 h）、改良神经功能缺损评分（modified Neurological severity scores,mNSS）（TBI后6 h）、计算不同EEG频带能量占比。实验二腹侧中脑导水管周围灰质区P2RX7通路介导井穴刺络法促醒效应研究SD大鼠随机分4组（n=8）:假手术+DMSO溶剂（Sham）、模型+DMSO溶剂（TBI）、井穴刺络法+DMSO溶剂（Hand Acu）、井穴刺络法+P2RX7拮抗剂（Hand Acu+anti-P2RX7）。大鼠均在vPAG区注射0.5 h后进行造模,Hand Acu和Hand Acu+anti-P2RX7组予以井穴刺络法。效应指标为昏迷时长、六级意识评分（TBI后3 h、4 h、5 h、6 h）、mNSS评分（TBI后6 h）。实验三P2RX7通路参与井穴刺络法调控下丘脑外侧区多巴胺D2受体和食欲素能神经元研究利用免疫荧光染色将DRD2+c-fos+DAPI、ORX+c-fos+DAPI、DRD2+ORX+DAPI共染,检测Sham、TBI、Hand Acu、Hand Acu+anti-P2RX7组下丘脑LH区的表达,探讨vPAG区P2RX7通路介导该法促醒TBI的下丘脑调控作用。实验四P2RX7通路参与井穴刺络法调控下丘脑结节乳头核区多巴胺D2受体和组胺能神经元研究利用免疫荧光染色将DRD2+c-fos+DAPI共染,利用免疫组化对HA进行染色,检测Sham、TBI、Hand Acu、Hand Acu+anti-P2RX7组下丘脑TMN区的表达,探讨vPAG区P2RX7通路介导该法促醒TBI的下丘脑调控作用。结果:1.井穴刺络法缩短TBI大鼠的昏迷时长并改善其意识状态（1）井穴刺络法缩短TBI大鼠的昏迷时长并改善其意识水平。①TBI大鼠昏迷时长较Sham组延长提示模型制备成功(**P＜0.01,v.s.Sham);井穴刺络法显著降低TBI大鼠的昏迷时长(▲▲P＜0.01,v.s.TBI)。②六级意识评分显示:TBI大鼠意识状态较Sham组下降(TBI后3 h、4 h、5 h、6 h:**P＜0.01,v.s.Sham);井穴刺络法可改善TBI后意识状态(TBI后4 h:▲P＜0.05;TBI后5 h、6 h:▲▲P＜0.01,v.s.TBI)。③TBI大鼠mNSS评分较Sham组上调(**P＜0.01,v.s.Sham),提示存在神经缺损症状;井穴刺络法可下调mNSS评分,改善TBI后神经功能缺损症状(▲▲P＜0.01,v.s.TBI)。（2）基于EEG信号分析明确井穴刺络法可改善TBI昏迷大鼠的昏迷程度。①根据EEG彩色频谱图所显示的大鼠昏迷状态和清醒状态,TBI组昏迷时长较Sham组延长(**P＜0.01,v.s.Sham);井穴刺络法可缩短大鼠TBI后昏迷时长(▲▲P＜0.01,v.s.TBI)。②（δ+θ）/（α+β）为昏迷波与清醒波的比值,TBI组该值均高于Sham组(TBI后30-50、100-110 min:**P＜0.01;TBI后50-70、90-100 min:*P＜0.05,v.s.Sham),井穴刺络法可通过增加清醒波并降低昏迷波以下调（δ+θ）/（α+β）值(TBI后30-40 min:##P＜0.01;TBI后40-50、100-110 min:#P＜0.05,v.s.TBI)。③（δ+θ）/（δ+θ+α+β）为昏迷波在总EEG占比,TBI后大鼠昏迷波增多(TBI后30-60、70-80、90-110 min:**P＜0.01;TBI后60-70,80-90 min:*P＜0.05,v.s.Sham)。井穴刺络法可下调（δ+θ）/（δ+θ+α+β）值以改善TBI后昏迷状态（TBI后30-50、100-110 min:#P＜0.05,v.s.TBI）。④（α+β）/（δ+θ+α+β）为清醒波在总EEG占比,TBI后大鼠清醒波减少(TBI后30-60、70-80、90-110 min:**P＜0.01;TBI后60-70、80-90 min:*P＜0.05,v.s.Sham),井穴刺络法可上调（α+β）/（δ+θ+α+β）值以提高TBI后清醒状态（TBI后30-50,100-110 min:#P＜0.05,v.s.TBI）。⑤γ波作为高频快波,其频带能量在TBI后均低于Sham组(TBI后30-110 min:**P＜0.01,v.s.Sham),井穴刺络法可上调γ波频带能量,在一定程度上提高大鼠TBI后的兴奋程度(TBI后100-120 min:##P＜0.01,v.s.TBI)。以上结果提示该法可增加TBI大鼠皮层醒觉相关EEG,是大鼠苏醒的表征之一。2.vPAG区P2RX7通路介导井穴刺络法促醒①TBI后大鼠昏迷时长较Sham组延长(**P＜0.01,v.s.Sham),井穴刺络法可缩短TBI大鼠的昏迷时长(▲▲P＜0.01,v.s.TBI),拮抗P2RX7可拮抗该效应(##P＜0.01,v.s.Hand Acu)。②六级意识评分结果显示:TBI后大鼠意识状态较Sham组下降(TBI后3 h、4 h、5 h、6 h:**P＜0.01,v.s Sham),井穴刺络法可改善其意识状态(TBI后4h:▲P＜0.05;TBI后5 h、6 h:▲▲P＜0.01,v.s.TBI),拮抗P2RX7可拮抗该效应(TBI后4 h:#P＜0.05;TBI后5 h、6 h:##P＜0.01,v.s.Hand Acu)。③TBI后大鼠mNSS评分较Sham组升高(**P＜0.01,v.s.Sham),井穴刺络法可下调mNSS评分,改善其神经功能缺损症状(▲▲P＜0.01,v.s.TBI),拮抗P2RX7可拮抗该效应(##P＜0.01,v.s.Hand Acu)。以上结果提示vPAG区P2RX7通路参与井穴刺络法促醒效应。3.井穴刺络法可激活下丘脑外侧区多巴胺D2受体和食欲素,上调该区多巴胺D2受体表达食欲素,且腹侧中脑导水管周围灰质注射P2RX7拮抗剂可拮抗该法的调控作用。（1）拮抗vPAG区P2RX7通路可拮抗井穴刺络法对下丘脑LH区DRD2的上调和激活效应。大鼠TBI后LH区DRD2+、c-fos+、DRD2+c-fos+细胞百分比较Sham组减少(DRD2+:**P＜0.01;c-fos+:*P＜0.05;DRD2+c-fos+:**P＜0.01,v.s.Sham),井穴刺络法可上调TBI昏迷后大鼠LH区DRD2+细胞数和兴奋性(▲▲P＜0.01,v.s.TBI),拮抗vPAG区P2RX7可拮抗该效应(##P＜0.01,v.s.Hand Acu)。计算均表达DRD2+与c-fos+细胞数在DRD2+占比:井穴刺络法可上调TBI后LH区具有神经兴奋性的DRD2+比例（▲P=0.017,v.s.TBI）,拮抗vPAG区P2RX7后,具有神经兴奋性的DRD2+比例较Hand Acu组下调18.4%。（2）拮抗vPAG区P2RX7通路可拮抗井穴刺络法对下丘脑LH区ORX能神经元的上调和激活效应。大鼠TBI后LH区ORX+、c-fos+、ORX+c-fos+细胞百分比较Sham组下降(ORX+:**P＜0.01;c-fos+:*P＜0.05;ORX+c-fos+:*P=0.012,v.s.Sham),井穴刺络法可上调TBI昏迷后大鼠LH区ORX+细胞数和兴奋性(▲▲P＜0.01,v.s.TBI),拮抗vPAG区P2RX7可拮抗该效应(##P＜0.01,v.s.Hand Acu)。计算均表达ORX+与c-fos+细胞数在ORX+占比:井穴刺络法可上调TBI后LH区具有神经兴奋性的ORX+比例(▲▲P＜0.01,v.s.TBI),拮抗vPAG区P2RX7可拮抗该效应(##P＜0.01,v.s.Hand Acu)。（3）拮抗vPAG区P2RX7通路可拮抗井穴刺络法对下丘脑LH区ORX能神经元与DRD2共表达的上调效应。大鼠TBI后LH区DRD2+、ORX+、DRD2+ORX+细胞百分比较Sham组下降(DRD2+:*P=0.014;ORX+:**P＜0.01;DRD2+ORX+:*P=0.019,v.s.Sham),井穴刺络法可上调TBI后LH区DRD2+和ORX+以及DRD2+ORX+细胞的表达(▲▲P＜0.01,v.s.TBI),拮抗vPAG区P2RX7可拮抗该效应(##P＜0.01,v.s.Hand Acu)。计算下丘脑LH区ORX+表达在DRD2+细胞数百分比:井穴刺络法可将TBI后LH区（ORX+DRD2+）/（DRD2+）比值上调29.4%,拮抗P2RX7后该比值较Hand Acu组下调24.4%。4.井穴刺络法可激活丘脑结节乳头核区多巴胺D2受体,抑制组胺的表达,且腹侧中脑导水管周围灰质注射P2RX7拮抗剂可拮抗该法的调控作用。（1）拮抗vPAG区P2RX7通路可拮抗井穴刺络法对下丘脑TMN区DRD2的上调和激活效应。大鼠TBI后TMN区DRD2+、c-fos+、DRD2+c-fos+细胞百分比较Sham组下降(**P＜0.01,v.s.Sham),井穴刺络法可上调TBI昏迷大鼠TMN区DRD2+细胞数和兴奋性(▲▲P＜0.01,v.s.TBI),拮抗vPAG区P2RX7可拮抗该效应(##P＜0.01,v.s.Hand Acu)。计算均表达DRD2+与c-fos+细胞数在DRD2+占比:井穴刺络法可将TBI后TMN区具有神经兴奋性的DRD2+比例上调14.2%,拮抗P2RX7后,具有神经兴奋性的DRD2+比例较Hand Acu组下调18%。（2）拮抗vPAG区P2RX7通路可拮抗井穴刺络法对下丘脑TMN区HA能神经元表达的下调效应。大鼠TBI后下丘脑TMN区HA+细胞百分比上调(**P＜0.01,v.s.Sham),井穴刺络法可下调TBI大鼠的HA+细胞表达量(▲▲P＜0.01,v.s.TBI),拮抗vPAG区P2RX7可拮抗该效应(##P＜0.01,v.s.Hand Acu)。结论:1.基于脑电波监测平台证实井穴刺络法可促醒重型颅脑创伤后昏迷大鼠。2.井穴刺络法可增加下丘脑外侧区表达多巴胺D2受体和食欲素的神经元及其活性;并可上调下丘脑结节乳头核区多巴胺D2受体的神经元数量和兴奋性,抑制组胺的表达。3.腹侧中脑导水管周围灰质区P2RX7通路介导井穴刺络法促醒效应及其对下丘脑的多巴胺D2受体、食欲素及组胺神经元的调控作用。