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目的:探索关节腔回输正常大鼠电针后血清外泌体（Acupuncture-exosomes,Acuexo）治疗佐剂性关节炎（Adjuvant arthritis,AA）大鼠的量效规律及可能的作用靶标,为针灸基础研究临床转化提供实验依据。方法:研究内容一:关节腔回输正常大鼠Acu-exo对AA大鼠的量效规律研究实验一:正常大鼠Acu-exo的提取鉴定将30只健康雄性Wistar大鼠随机分为两组,每组15只。电针组取大鼠双侧足三里穴、环跳穴,使用1寸针灸针针刺后连接电针仪刺激上述穴位。电针参数为:疏密波2/10Hz,强度5/10/15各10min共30min,隔天针刺,针刺14次共28天。空白组不针刺,仅固定于实验台。最后一天采集腹主动脉血使用Exo Quick Precipitation试剂盒提取外泌体（Exosome,Exo）。将提取的外泌体通过透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）、纳米颗粒粒径跟踪分析（Nanoparticle tracking analysis,NTA）、蛋白质免疫印迹法（Western blot,WB）三种方法鉴定所提取的血清外泌体形态、大小及标志物。实验二:关节腔回输正常大鼠Acu-exo治疗AA大鼠的量效规律使用完全弗式佐剂（complete Freund’s adjuvant,CFA）复制AA大鼠模型,随机分为5.2mg/m L组、2.6mg/m L组、1.3mg/m L组、PBS盐水组、模型组。所有大鼠测量基线数据后依据分组分别于踝关节腔回输不同浓度正常大鼠Acu-exo或PBS溶液。定期测量大鼠热辐射缩足痛阈（Paw withdrawal latency,PWL）及足肿胀。取材后检测血清白介素6（Interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）;检测足垫及脊髓部位环氧化酶2（Cyclooxygenase-2,COX-2）含量;光学显微镜下观察足垫、踝关节的组织病理切片,观察各组炎性浸润程度以探索关节腔回输正常大鼠Acu-exo治疗AA的最佳浓度。研究内容二正常大鼠Acu-exo对AA大鼠的网络作用机制初探实验一:基于复杂网络分析的正常大鼠Acu-exo网络作用机制研究提取出两组大鼠血清Exo运载的内含蛋白,使用定量蛋白质组学技术检测两组血清Exo运载的内含蛋白。采集数据后,使用Maxquant软件进行查库鉴定及定量分析。查库鉴定了两组血清Exo蛋白种类和数量,筛选出两组间变化倍数大于1.5倍（p＜0.05）的显著差异蛋白。将筛选出的显著差异蛋白使用GO功能数据库查找出显著差异蛋白的分子功能、使用Uniprot蛋白数据库查找出显著差异蛋白的相互作用蛋白及二者关联程度、使用KEGG信号通路数据库查找出显著差异蛋白的信号通路、使用The Human Gene Database人类基因数据库查找出显著差异蛋白的来源及关联程度。以检测出的显著差异蛋白为源节点（Source）,以通过以上数据库查出的相应靶点为目标节点（Target）,以两者之间关联程度为权重（Weight）使用Gephi软件分别构建显著差异蛋白-分子功能网络拓谱图、显著差异蛋白-相互作用蛋白网络拓谱图、显著差异蛋白-KEGG信号通路网络拓谱图、显著差异蛋白-来源网络拓谱图。运行连入度、加权入度、Page Rank。根据连入度、加权入度、Page Rank综合筛选出与差异蛋白关联程度最高的前20位分子功能、相互作用蛋白、信号通路及来源。实验二:基于类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）疾病靶标的正常大鼠Acu-exo起效靶标初步筛选将实验一中显著差异蛋白的相互作用蛋白排名前20位的关键相互作用蛋白依次输入Uniport蛋白数据库网站,转换成对应的大鼠基因后再将对应的大鼠基因通过HGNC网站映射为人类基因并剔除重复基因。通过Gene Cards数据库、OMIM数据库、Dis Ge NET数据库查找出RA疾病靶标并剔除重复靶标。将映射出的人类基因与RA疾病靶标取交集,找出共同靶标。结果:1.正常大鼠Acu-exo提取及鉴定结果符合国际细胞外囊泡协会标准使用BCA蛋白定量试剂盒测定电针组、空白组两组血清Exo的蛋白浓度。针刺组Acu-exo蛋白浓度为13.671mg/m L,空白组Exo蛋白浓度为15.384mg/m L。透射电子显微镜镜下两组血清Exo均呈圆形或类圆形的囊泡状,可见膜性结构,直径在70～200nm之间。纳米颗粒跟踪分析显示针刺组血清Exo及空白组血清Exo算术平均径分别为93.5nm与77.1nm;峰值粒径分别为93.02nm与118.74nm,曲线图流畅。WB检测血清Exo形成过程中的重要蛋白,CD9、CD63、TSG101均出现明显条带,阴性对照蛋白Clanexim无条带,两组Exo均未受杂蛋白干扰。两组血清Exo完全符合2018年国际细胞外囊泡协会（International Society for Extracellular Vesicles,ISEV）发布的鉴定标准,可用于进一步生物学分析。2.踝关节腔回输正常大鼠不同浓度Acu-exo治疗AA大鼠疗效存在差异踝关节腔回输正常大鼠Acu-exo对AA大鼠具有治疗效应,且正常大鼠Acu-exo对AA大鼠具有一定量效关系:踝关节腔回输2.6mg/m L正常大鼠Acu-exo的大鼠PWL值于第一次回输即产生疗效,并与其他各组均有统计学差异（P＜0.05）;踝关节腔第二次回输后,2.6mg/m L组大鼠足肿胀程度比其他各组明显下降（P＜0.05）。2.6mg/m L组血清IL-6、TNF-α水平均低于其他各组（P＜0.05）;2.6mg/m L组足垫COX-2水平低于其他各组（P＜0.05）,与PWL结果一致;各组脊髓COX-2水平无统计学差异,但2.6mg/m L组平均值水平最低。关节腔回输中浓度正常大鼠Acu-exo可在一定程度上防止AA大鼠的踝关节滑膜软骨破坏。据此可认为中等浓度（2.6mg/m L）正常大鼠Acuexo疗效最佳;3.基于网络生物学发现,正常大鼠Acu-exo作用机制复杂,涉及多个蛋白及通路Label Free蛋白组学筛选出263个显著差异蛋白。显著差异蛋白主要分子功能为protein binding（蛋白质结合）、receptor binding（受体结合）、antigen binding（抗原结合）、immunoglobulin receptor binding（免疫球蛋白受体结合）;与显著差异蛋白关联程度高的相互作蛋白有Igg-1a（抗体免疫球蛋白）、C3（补体C3）、Ahsg（胎球蛋白A）、Apoa1（载脂蛋白A1）、C2（补体C2）等;参与的信号通路主要为蛋白酶体、补体和凝血级联、代谢途径;显著差异蛋白来源主要为循环系统、运动系统、生殖系统等。4.正常大鼠Acu-exo对RA起效作用靶标与免疫调节关系密切正常大鼠Acu-exo运载的C3（补体C3）、AHSG（α2-巯基糖蛋白）、APOA1（载脂蛋白A-Ⅰ）、C2（补体C2）、CFB（补体因子B）、FN1（纤连蛋白）、IGHM（免疫球蛋白重链M）、IGHG3（免疫球蛋白重链γ-3）、F2（凝血因子II）、C7（补体C7）、PSMA5（蛋白酶体亚基α-5）、CLU（簇集素）、C4A（补体C4-A）、SERPINC1（抗凝血酶Ⅲ）、PSMB1（蛋白酶体亚基β-1）、PSMA4（蛋白酶体亚基α-4）、PLG（纤溶酶原）、LPA（载脂蛋白a）可能是针刺治疗类风湿性关节炎疾病的有效靶标。结论:1.踝关节腔回输正常大鼠Acu-exo治疗AA大鼠具有一定的量效规律。2.外泌体可能是针刺网络调节的重要载体,正常大鼠Acu-exo运载的C3、AHSG、APOA1、C2、CFB、FN1、IGHM、IGHG3等可能是针刺通过免疫调节治疗RA的重要靶标。