【摘 要】
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松材线虫携带的荧光假单胞菌GeM5-1A(Pseudomonas fluorescens GcM5-1A)的鞭毛蛋白可以通过诱导黑松细胞的死亡从而促进松材线虫及荧光假单胞菌自身的繁殖。为研究鞭毛蛋白在
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松材线虫携带的荧光假单胞菌GeM5-1A(Pseudomonas fluorescens GcM5-1A)的鞭毛蛋白可以通过诱导黑松细胞的死亡从而促进松材线虫及荧光假单胞菌自身的繁殖。为研究鞭毛蛋白在松萎蔫病中的作用机理,本文利用PCR技术从荧光假单胞菌GcM5-lA的基因组中克隆了鞭毛蛋白编码基因flic,(?)将该基因克隆到表达载体pET-15b的NcoI和XhoI位点,构建重组质粒pET-15b-fliC,将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3),构建工程菌,IPTG诱导工程菌高效表达C-末端具有多聚组氨酸标签的重组鞭毛蛋白,重组蛋白主要以包涵体的形式存在,包涵体经8mol/L尿素溶解,复性并经Ni2+螯合柱亲和层析得到了电泳纯的重组鞭毛蛋白。生测结果表明,重组鞭毛蛋白可引起黑松细胞的大量死亡,100μg/mL重组鞭毛蛋白处理黑松细胞30h,死亡率达到72%以上。经重组鞭毛蛋白处理后的黑松愈伤组织悬浮细胞与天然鞭毛蛋白处理的黑松愈伤组织细胞有相似的形态变化,证明通过基因手段重组表达的鞭毛蛋白与天然的荧光假单胞菌鞭毛蛋白在松萎蔫病致病过程中有相类似的作用机理。利用重组的鞭毛蛋白作为配体,通过与提取的黑松细胞膜上的全蛋白特异结合来寻找鞭毛蛋白的结合膜蛋白,鞭毛蛋白与结合蛋白形成的复合体加热变性并经SDS-PAGE分离后,得到了大小约为50kDa的膜蛋白。将分离到的结合蛋白进行N末端序列测定,该蛋白可能的N端序列：NH2-Glu-Val-Asn-Val-Ala-Thr-Ala-Ile-Met-Gln。该研究为从分子水平研究鞭毛蛋白在松萎蔫病病理进程中的作用奠定了基础。
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