从血小板与肿瘤细胞相互作用探讨丹酚酸b的抗乳腺癌转移作用及其机制

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目的:以乳腺癌细胞和血小板之间的相互作用作为切入点,研究在血小板介导下,丹酚酸b抗乳腺癌转移作用及其机制,并与P2Y12受体拮抗剂替格瑞洛进行对比研究。方法:1.实验采用MDA-MB-231和MDA-MB-468两株三阴性乳腺癌细胞进行研究。2.将实验设为11组,分别为血小板组(终密度为2×10~7个/m L),血小板+丹酚酸b组(丹酚酸b终浓度分别为3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM),血小板+替格瑞洛组(替格瑞洛终浓度分别为3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM),采用SRB法筛选丹酚酸b和替格瑞洛的最佳给药剂量。3.将两株人乳腺癌细胞系分为空白组,空白给药中剂量组,血小板组与给药组,丹酚酸b和替格瑞洛分别设置低、中、高(终浓度均为3.125μM、6.25μM、12.5μM)剂量组,每次实验均设立一个对比药物的中剂量组(后续实验均以此进行分组),作用48h后观察各组细胞形态是否发生变化。4.Transwell法测定在肿瘤-活化血小板体系中,丹酚酸b和替格瑞洛对肿瘤细胞纵向迁移和侵袭的影响。5.采用细胞划痕法测定在肿瘤-活化血小板体系中,丹酚酸b和替格瑞洛对肿瘤细胞横向迁移的影响。6.借助ECM阵列试剂盒检测在肿瘤-活化血小板体系中,丹酚酸b和替格瑞洛对肿瘤细胞在不同基质胶中黏附作用的影响。7.利用细胞免疫荧光法检测E-cadherin、CK-19蛋白以及Vimentin蛋白的定位与表达情况。8.利用Western blot法检测E-cadherin、CK-19蛋白,和Vimentin、N-cadherin蛋白的表达,以及锌指转录因子p-Snail/Snail、p-Slug/Slug的表达情况。结果:1.SRB法结果显示,在血小板干预下,丹酚酸b和替格瑞洛最大浓度为12.5μM时,细胞存活率大于80%,满足实验需求。2.血小板和药物作用于两株人乳腺癌细胞系48h后,血小板组细胞形态细胞连接松散,形成伪足,给药组随浓度增加抑制细胞形态变化。3.Transwell法显示血小板组的细胞纵向迁移和侵袭数目增加,丹酚酸b和替格瑞洛组随药物的剂量增加细胞迁移与侵袭数目逐渐减少,细胞划痕实验结果趋势与其类似。4.免疫荧光实验表明,血小板组的E-cadherin与CK-19蛋白表达下调,给药组则上调,相反,Vimentin蛋白表达上调,给药组则下调。5.Western blot实验结果表明,血小板组的E-cadherin、CK-19蛋白表达减少,给药组则增多,相反,血小板组N-cadherin、Vimentin蛋白,以及p-Snail/Snail、p-Slug/Slug的比值均增加,给药组则减少。结论:1.血小板能显著促进肿瘤细胞迁移、侵袭与黏附等细胞的转移能力,丹酚酸b可抑制血小板诱导体系下肿瘤细胞的迁移、侵袭与黏附能力。2.丹酚酸b的抗转移作用与其EMT逆转作用有关,其机制可能与Snail、Slug等多种EMT相关转录因子活化有关,但其确切分子机制仍有待探索。3.替格瑞洛与丹酚酸b表现类似药理作用,提示丹酚酸b起效机制或与抑制血小板活化有关。
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