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目的：
1.利用分子生物学技术构建原核表达重组质粒pET32a(+)/HPVGb E7和pET32a(+)/HPVll E7,并在大肠杆菌中表达HPVGb和11 E7融合蛋白.
2.制备HPV6b和11 E7融合蛋白诊断抗原,采用ELISA方法检测尖锐湿疣患者血清和阴道分泌物抗体水平,研究该蛋白的抗原性,为HPV6b和11型感染的诊断研究奠定基础.
方法：
1.利用HPV 6b和11型特异性引物,扩增HPV6b和11型E7蛋白基因的全长序列,扩增产物分别定向插入到原核表达载体pET32a(+)中,分别构建重组质粒pET32a(+)/HPV6b E7和pET32a.(+)/HPVll E7,并经酶切和测序分析鉴定.
2.重组质粒pET32a(+)/HPV6b E7和pET32a(+)/HPVll E7分别转化至E.ColiBL21(DE3)中,经诱导表达融合蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot方法分析鉴定.
3.采用Ni-NTA hgarose亲和层析柱纯化HPV6b和11 E7融合蛋白,并以HPV6b和11型阳性血清作一抗,进一步用Western blot分析该融合蛋白的抗原性.
4.分别以纯化的HPV6b和11 E7融合蛋白作诊断抗原,用间接ELISA法检测尖锐湿疣患者(106例)、宫颈癌患者(43例)及健康对照者(98例)血清IgG抗体和CA患者(77例)、健康对照者(115例)阴道分泌物sIgA抗体.根据健康对照组血清及阴道分泌物抗体的平均A值计算出阳性判定值(Cut off值)(健康对照组血清及阴道分泌物抗体平均A值+2S),以此评估尖锐湿疣患者的血清和阴道分泌物抗体阳性检出率及ELISA方法诊断尖锐湿疣的敏感度和特异度;并分别比较HPV6b和11 E7融合蛋白血清及阴道分泌物抗体水平与HPV感染型别的关系,以分析基于目的蛋白的ELISA方法用于诊断HPV6b和11型感染的敏感度.
5.统计学分析:采用SPSS8.0统计软件进行方差分析,进一步两两比较用Tamhane法,各组间血清抗体阳性率的比较采用x<2>检验法,显著性检验水平均为0.05.
结果：
1.经酶切和测序证明成功构建pET32a(+)/HPV6b E7和pET32a(+)/HPV11 E7重组质粒;重组质粒分别在大肠杆菌E.Coli BL21(DE3)内成功表达了融合蛋白,经SDS-PAGE电泳分析见约30kDa大小的蛋白条带,并经Western blot鉴定为目的蛋白,HPV6b和HPV11 E7融合蛋白纯化后通过核酸蛋白检测仪检测的浓度分别为40μg/ml和46μg/ml;分别以HPV6b E7和HPV11 E7阳性CA患者血清作一抗,经Western blot鉴定HPV6b E7和HPV11E7融合蛋白具有较强抗原性.成功制备并纯化了用于CA诊断的ELISA抗原.
2.分别以HPV6b E7和HPV11 E7融合蛋白作为诊断抗原用,间接ELISA方法检测CA患者、宫颈癌患者和健康对照者血清IgG抗体:①HPV6b E7抗体均值分别为1.655±0.130、1.366±0.110和1.44±0.14;HPV11 E7抗体均值分别为1.545±0.131、0.586±0.155和0.674±0.150.CA组较宫颈癌组及健康对照组HPV6b E7和HPV11 E7抗体均值差异均有显著性(P<0.01),而宫颈癌组较对照组抗体均值差异均无显著性(P>0.05).②HPV6b E7抗体阳性率分别为67.9﹪(70/106)、13.9﹪(6/43)和7.1﹪(7/98);HPV11 E7抗体阳性率、分别为75.5﹪(80/106)、11.6﹪(5/43)和7.1﹪(7/98).CA组较宫颈癌组及健康对照组HPV6bE7和HPV11 E7抗体阳性率差异均有显著性(P<0.01)而宫颈癌组较对照组差异则均无显著性(P>0.05).③CA组中女性患者HPV6b E7和HPV11E7抗体阳性率分别为73.3﹪(66/90)和82.5﹪(74/90),男性患者抗体阳性率分别为25﹪(4/16)和37.5﹪(6/16).女性组均高于男性组(P<0.01).④基于HPV6b E7和HPV11 E7融合蛋白的ELISA用于检测CA患者敏感度分别为67.9﹪(70/106)和75.5﹪(80/106);特异度均为92.9﹪(91/98).
3.分别以HPV6b E7和HPV11 E7融合蛋白作为诊断抗原,用间接ELISA方法检测CA患者和健康对照者阴道分泌物sIgA抗体:①HPV6b E7抗体均值分别为0.061±0.01和0.060±0.0047,HPV11 E7抗体均值分别为0.07±0.01和0.05±0.007.CA患者较健康对照组抗体均值差异均有显著性(P<0.01).②HPV6bE7抗体阳性率分别为42.9﹪(33/77)和7.8﹪(9/115),HPV11 E7抗体阳性率分别为6.3﹪(28/77)和5.2﹪(6/115).CA组阳性率较健康对照组差异均有显著性(P<0.01).③基于HPV6b E7和HPVII E7融合蛋白的ELISA用于检测CA患者敏感度分别为42.9﹪(33/77)和36.3﹪(28/77);特异度分别为92.2﹪(106/115)和94.8﹪(109/115).
4.76例CA患者湿疣组织和117例健康对照者阴道分泌物,用PCR方法检测HPV6b和HPV11 DNA.结果:CA患者湿疣组织中HPV6b和HPV11型DNA阳性率分别为77.6﹪(59/76)和56.6﹪(43/76);健康对照者阴道分泌物中HPV6b和HPV11型DNA阳性率分别为8.5﹪(10/117)和3.4﹪(4/117).
5.分别以HPV6b E7和HPV11 E7融合蛋白作为诊断抗原,用间接ELISA法分别对经选择的HPV6 DNA阳性(44例)、HPV11DNA阳性(35例)血清和阴道分泌物抗体.结果,HPV6 E7血清IgG抗体阳性率分别为93.2﹪(41/44)和71.4﹪(25/35),阴道分泌物slgA抗体阳性率分别为54.6﹪(24/44)和28.6﹪(10/35);hPV11 E7血清IgG抗体阳性率为68.2﹪(30/44)和97.1﹪(34/35),阴道分泌物slgA抗体阳性率为20.5﹪(9/44)和48.6﹪(17/35).HPV6和HPV11 DNA与HPVl6 DNA阳性患者抗体阳性率差异均有显著性(P<0.01).
结论：
1.成功构建重组原核表达质粒pET32a(+)/HPV6b E7和pET32a(+)/HPV11E7:并在原核细胞表达系统内成功表达融合蛋白.
2.以HPV6b E7和HPVll E7融合蛋白作为诊断抗原,用ELISA法可以成功检测CA患者和健康对照者血清和阴道分泌物及宫颈癌血清特异性抗体,HPV6 E7和HPV11 E7融合蛋白具较强的抗原性,HPV6及11型抗体间无交叉反应.HPV6b E7和HPV11 E7融合蛋白对CA诊断试剂的研究具有应用价值.