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第一部分:CNP对大鼠附睾炎的抗炎免疫作用
【目的】①探究体外CNP是否对大鼠附睾炎存在抗炎作用；②利用RNA-seq测序分析，找到与附睾炎发生和防御相关的免疫调节因子及信号通路。
【方法】①利用UPEC建立大鼠附睾头部炎动物模型，并用CNP(50 ug/kg)连续3天腹腔干预治疗,所有大鼠分三组(每组5只)：空白对照组(Control)；UPEC；UPEC+CNP；②酶联免疫吸附方法(Enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)检测各组附睾头部液中CNP的含量，明确CNP腹腔注射的有效性；③HE染色及附睾指数测量，评估各组附睾头部器质性损伤程度，qPCR及ELISA检测炎症因子的水平，Westernblot检测NF-kB蛋白表达；④应用转录组学进行基因测序分析并qPCR验证。
【结果】①从肉眼观看，经过UPEC建模72h后，大鼠阴囊部有红肿现象，UPEC组解剖后发现附睾头部出现明显的红肿，而UPEC+CNP组附睾头部炎症程度明显缓解，附睾指数比UPEC组低；②附睾头部组织HE染色结果显示：UPEC组内附睾管腔及间质内充满着大量的炎症细胞、成纤维细胞，附睾上皮细胞塌陷、排列紊乱，管腔内无正常精子，而UPEC+CNP组炎症细胞浸润较少，管腔上皮细胞排列较规整，炎症细胞未侵入管腔；③ELISA检测大鼠附睾头部液中的CNP含量发现：CNP处理组中附睾头液CNP浓度明显高于空白对照组(p<0.05)；④转录组学测序分析显示：UPEC组与Control组相比，上调了666个基因，下调了625个基因。而UPEC+CNP组与UPEC组相比，上调了95个基因，下调了304个基因；从功能学角度分析，UPEC相比于Control上调的及UPEC+CNP相比于UPEC下调的这些交叉集合基因主要参与了促炎反应、炎症细胞的迁徙、固有免疫防御反应等。从GO及KEGG分析来看，炎症发生的信号通路主要为：经典的NF-kB信号通路、MYD88(Myeloiddifferentiationfactor88)信号通路、TNF-a信号通路以及细胞因子-细胞因子受体信号通路，而炎症防御反应主要是固有免疫防御；⑤qPCR验证：UPEC组附睾头部组织内促炎基因(如：IL-6、TNF-a、IL-1b、Gata4、Mmp8、Alox5aP、Ncfb1等)高于UPEC+CNP组(p<0.05)，然而对于防御基因(如：Defb1、Bin1b、Gbp1等)，UPEC+CNP组高于UPEC组(p<0.05)；⑥应用ELISA检测附睾头部组织液中IL-6、TNF-a含量及Westernblot检测NF-kB蛋白，结果显示在UPEC组中的表达均明显高于对照组(p<0.05)，而UPEC+CNP组均可明显减少UPEC所诱导的表达(p<0.05)。
【结论】①CNP干预附睾炎后，可减轻附睾炎的器质性损伤；②UPEC所导致的附睾炎，能够引起炎症发生相关基因(如：IL-6、TNF-a、IL-1b等)的高表达，而CNP可通过抑制NF-kB信号通路和上调防御中某些基因来发挥抗炎保护作用。
第二部分:CNP在附睾炎中的抗炎机制初探
第一节:CNP体内外抑菌实验的探讨
【目的】探究CNP在体内体外抑制UPEC菌的效果。
【方法】①涂皿计数检测大鼠附睾炎模型中各组附睾头部液中UPEC的含量，qPCR检测各组组织UPEC鞭毛特有基因PapCmRNA表达；②不同浓度的CNP体外孵育等量的UPEC，一定时间后，酶标仪检测各组菌液浑浊度及UPEC活性，涂皿计数检测最终繁殖后菌落数。
【结果】①大鼠UPEC模型组中附睾头部液中菌量检测：UPEC组菌量最多，UPEC特异性鞭毛基因PapC表达量相对于UPEC+CNP组和Control组高(p<0.05)；②CNP(10-5、10-6、10-7 mol/L)体外处理UPEC6h后，细菌浑浊度和活性均低于UPEC组，并且菌落数量上也较UPEC组的数量显著少(p<0.001)。
【结论】CNP在体内体外均可抑制UPEC的生长繁殖，但具体机制仍待进一步探究。
第二节:CNP对巨噬细胞的免疫调节作用及机制研究
【目的】①明确CNP在体内是否可抑制炎症巨噬细胞的侵袭；②CNP在体外是否可抑制炎症巨噬细胞分泌促炎因子；③CNP在体外抑制抗炎信号通路的探究。
【方法】①体内实验：免疫组化检测大鼠附睾炎模型中各组附睾头部巨噬细胞量；②体外实验：用LPS(100 ug/ml)及CNP10-7mol/L共同孵育巨噬细胞不同时间6h、12h、16h、24h后，qPCR及ELISA检测巨噬细胞中IL-6、TNF-a、IL-1b水平的表达水平及分泌浓度。并在CNP孵育炎症巨噬细胞不同时间后，用CCK-8检测其增殖活性；③在LPS孵育巨噬细胞的基础上，加入信号通路中cGMP类似物(8-Br-cGMP)10-4mol/L以及PKG抑制剂(KT5823)10-6mol/L协同孵育巨噬细胞，具体分组如下：空白对照组(Control)；LPS；LPS+CNP；LPS+8-Br-cGMP；LPS+CNP+KT5823；LPS+8-Br-cGMP+KT5823，首先ELISA检测前三组巨噬细胞内cGMP水平，再Westernblot检测所有各组巨噬细胞NF-kB蛋白表达水平以及下游IL-6、TNF-a、IL-1bmRNA水平。
【结果】①巨噬细胞组化结果显示：UPEC组中，附睾间质及管腔内充满大量的巨噬细胞，UPEC+CNP组附睾上皮细胞较正常，间质内巨噬细胞浸润少；②qPCR及ELISA检测促炎因子：LPS+CNP组在6h、12h、16h、24h促炎因子IL-6、TNF-a、IL-1b较LPS组低(p<0.05)。CCK-8检测此4个时间点巨噬细胞增殖活性，LPS+CNP组也低于LPS组(p<0.05)；③ELISA结果显示：LPS+CNP组巨噬细胞内cGMP的浓度水平高于LPS组(p<0.05)；④Westernblot结果显示：与对照组相比,LPS组NF-kB蛋白表达水平明显增加，加入CNP和8-Br-cGMP后，其表达水平明显下降，KT5823可明显减弱CNP及8-Br-cGMP对炎症因子的下降作用。
【结论】①CNP体内可抑制炎症巨噬细胞对附睾头部的侵袭；②在体外，CNP可在不同时间点可抑制巨噬细胞释放促炎因子及抑制巨噬细胞增殖活性；③CNP可通过提高炎症巨噬细胞内cGMP及PKG的水平，下调NF-kB的表达，从而进一步影响下游促炎因子的释放。因此，CNP可在体内外抑制炎症巨噬细胞的浸润及活性，并通过CNP-cGMP/PKG-NF-kB信号通路发挥抗炎保护作用。
【目的】①探究体外CNP是否对大鼠附睾炎存在抗炎作用；②利用RNA-seq测序分析，找到与附睾炎发生和防御相关的免疫调节因子及信号通路。
【方法】①利用UPEC建立大鼠附睾头部炎动物模型，并用CNP(50 ug/kg)连续3天腹腔干预治疗,所有大鼠分三组(每组5只)：空白对照组(Control)；UPEC；UPEC+CNP；②酶联免疫吸附方法(Enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)检测各组附睾头部液中CNP的含量，明确CNP腹腔注射的有效性；③HE染色及附睾指数测量，评估各组附睾头部器质性损伤程度，qPCR及ELISA检测炎症因子的水平，Westernblot检测NF-kB蛋白表达；④应用转录组学进行基因测序分析并qPCR验证。
【结果】①从肉眼观看，经过UPEC建模72h后，大鼠阴囊部有红肿现象，UPEC组解剖后发现附睾头部出现明显的红肿，而UPEC+CNP组附睾头部炎症程度明显缓解，附睾指数比UPEC组低；②附睾头部组织HE染色结果显示：UPEC组内附睾管腔及间质内充满着大量的炎症细胞、成纤维细胞，附睾上皮细胞塌陷、排列紊乱，管腔内无正常精子，而UPEC+CNP组炎症细胞浸润较少，管腔上皮细胞排列较规整，炎症细胞未侵入管腔；③ELISA检测大鼠附睾头部液中的CNP含量发现：CNP处理组中附睾头液CNP浓度明显高于空白对照组(p<0.05)；④转录组学测序分析显示：UPEC组与Control组相比，上调了666个基因，下调了625个基因。而UPEC+CNP组与UPEC组相比，上调了95个基因，下调了304个基因；从功能学角度分析，UPEC相比于Control上调的及UPEC+CNP相比于UPEC下调的这些交叉集合基因主要参与了促炎反应、炎症细胞的迁徙、固有免疫防御反应等。从GO及KEGG分析来看，炎症发生的信号通路主要为：经典的NF-kB信号通路、MYD88(Myeloiddifferentiationfactor88)信号通路、TNF-a信号通路以及细胞因子-细胞因子受体信号通路，而炎症防御反应主要是固有免疫防御；⑤qPCR验证：UPEC组附睾头部组织内促炎基因(如：IL-6、TNF-a、IL-1b、Gata4、Mmp8、Alox5aP、Ncfb1等)高于UPEC+CNP组(p<0.05)，然而对于防御基因(如：Defb1、Bin1b、Gbp1等)，UPEC+CNP组高于UPEC组(p<0.05)；⑥应用ELISA检测附睾头部组织液中IL-6、TNF-a含量及Westernblot检测NF-kB蛋白，结果显示在UPEC组中的表达均明显高于对照组(p<0.05)，而UPEC+CNP组均可明显减少UPEC所诱导的表达(p<0.05)。
【结论】①CNP干预附睾炎后，可减轻附睾炎的器质性损伤；②UPEC所导致的附睾炎，能够引起炎症发生相关基因(如：IL-6、TNF-a、IL-1b等)的高表达，而CNP可通过抑制NF-kB信号通路和上调防御中某些基因来发挥抗炎保护作用。
第二部分:CNP在附睾炎中的抗炎机制初探
第一节:CNP体内外抑菌实验的探讨
【目的】探究CNP在体内体外抑制UPEC菌的效果。
【方法】①涂皿计数检测大鼠附睾炎模型中各组附睾头部液中UPEC的含量，qPCR检测各组组织UPEC鞭毛特有基因PapCmRNA表达；②不同浓度的CNP体外孵育等量的UPEC，一定时间后，酶标仪检测各组菌液浑浊度及UPEC活性，涂皿计数检测最终繁殖后菌落数。
【结果】①大鼠UPEC模型组中附睾头部液中菌量检测：UPEC组菌量最多，UPEC特异性鞭毛基因PapC表达量相对于UPEC+CNP组和Control组高(p<0.05)；②CNP(10-5、10-6、10-7 mol/L)体外处理UPEC6h后，细菌浑浊度和活性均低于UPEC组，并且菌落数量上也较UPEC组的数量显著少(p<0.001)。
【结论】CNP在体内体外均可抑制UPEC的生长繁殖，但具体机制仍待进一步探究。
第二节:CNP对巨噬细胞的免疫调节作用及机制研究
【目的】①明确CNP在体内是否可抑制炎症巨噬细胞的侵袭；②CNP在体外是否可抑制炎症巨噬细胞分泌促炎因子；③CNP在体外抑制抗炎信号通路的探究。
【方法】①体内实验：免疫组化检测大鼠附睾炎模型中各组附睾头部巨噬细胞量；②体外实验：用LPS(100 ug/ml)及CNP10-7mol/L共同孵育巨噬细胞不同时间6h、12h、16h、24h后，qPCR及ELISA检测巨噬细胞中IL-6、TNF-a、IL-1b水平的表达水平及分泌浓度。并在CNP孵育炎症巨噬细胞不同时间后，用CCK-8检测其增殖活性；③在LPS孵育巨噬细胞的基础上，加入信号通路中cGMP类似物(8-Br-cGMP)10-4mol/L以及PKG抑制剂(KT5823)10-6mol/L协同孵育巨噬细胞，具体分组如下：空白对照组(Control)；LPS；LPS+CNP；LPS+8-Br-cGMP；LPS+CNP+KT5823；LPS+8-Br-cGMP+KT5823，首先ELISA检测前三组巨噬细胞内cGMP水平，再Westernblot检测所有各组巨噬细胞NF-kB蛋白表达水平以及下游IL-6、TNF-a、IL-1bmRNA水平。
【结果】①巨噬细胞组化结果显示：UPEC组中，附睾间质及管腔内充满大量的巨噬细胞，UPEC+CNP组附睾上皮细胞较正常，间质内巨噬细胞浸润少；②qPCR及ELISA检测促炎因子：LPS+CNP组在6h、12h、16h、24h促炎因子IL-6、TNF-a、IL-1b较LPS组低(p<0.05)。CCK-8检测此4个时间点巨噬细胞增殖活性，LPS+CNP组也低于LPS组(p<0.05)；③ELISA结果显示：LPS+CNP组巨噬细胞内cGMP的浓度水平高于LPS组(p<0.05)；④Westernblot结果显示：与对照组相比,LPS组NF-kB蛋白表达水平明显增加，加入CNP和8-Br-cGMP后，其表达水平明显下降，KT5823可明显减弱CNP及8-Br-cGMP对炎症因子的下降作用。
【结论】①CNP体内可抑制炎症巨噬细胞对附睾头部的侵袭；②在体外，CNP可在不同时间点可抑制巨噬细胞释放促炎因子及抑制巨噬细胞增殖活性；③CNP可通过提高炎症巨噬细胞内cGMP及PKG的水平，下调NF-kB的表达，从而进一步影响下游促炎因子的释放。因此，CNP可在体内外抑制炎症巨噬细胞的浸润及活性，并通过CNP-cGMP/PKG-NF-kB信号通路发挥抗炎保护作用。