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氟是地球上广泛存在的元素,作为机体生命活动必需的微量元素,具有多方面的生理作用。近年来,国内外学者对氟及其化合物的生殖毒性作用进行了大量的研究。动物实验资料和人群流行病学调查资料证实氟不仅可以直接作用于睾丸和附睾,破坏其结构,造成生殖损伤,还可以通过干扰下丘脑一垂体一性腺轴和睾丸局部微环境,引起生殖毒性。生殖系统异常是人类内分泌系统异常的主要表现,在人类主要表现为:男性精子密度减小,质量下降,不育比例上升,睾丸癌患者增加；女性乳腺癌、子宫内膜症增加及不良生殖结局增加等。这种现象的产生被认为是环境中存在有干扰内分泌系统的化学物,并提出了环境内分泌干扰物的概念,环境内分泌干扰物(Environmental Endocrine Disruptors,EEDs)既能影响正常的激素产生、释放、运输、代谢或清除,还能影响同源受体结合和/或随后的细胞内受体作用。目前,氟对雄性生殖系统的损害,主要是氟对睾丸结构的破坏和精子的数量及质量的变化,还有对内分泌的影响等,但其作用机制目前还未见报道。
目的:
利用MA-10小鼠睾丸间质瘤细胞(MA-10 mouse Leydig tumor cells,mLTC-1)作为模型,观察NaF对睾丸间质瘤细胞睾酮合成的影响,并探讨其作用机制,为下一步研究提供理论依据。
方法：
1 MTT法检测mLTC-1细胞的活性,通过进行NaF对体外培养mLTC-1细胞的毒性实验确定染毒剂量为8μg/ml、12μg/ml、16μg/ml和20μg/ml,以无血清培养基为对照。
2.mLTC-1细胞培养基上清中孕酮(Progesterone)的分泌量:采用放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)将对数生长期的mLTC-1细胞接种到24孔板中。(1)分别加入浓度为0.0IU/ml、0.1IU/ml、1.0IU/ml、10.0IU/ml、100.0IU/ml的HCG,培养4h后,RIA法测各孔培养基中孕酮的含量；(2)单纯的10.0IU/ml HCG刺激和10.0IU/ml HCG和16Hg/ml NaF的混合刺激,分别在1h、2h、3h、6h、12h、24h取培养上清,RIA测定培养上清中孕酮的含量；(3)依次加入含NaF浓度为0、8、12、16和20μg/ml,含HCG浓度为10IU/ml的无血清的培养基,培养2h后,RIA测定上清中孕酮的含量。
3.mLTC-1细胞中StAR和P450scc mRNA表达水平:采用实时定量PCR法将铺满瓶底的80％以上的mLTC-1细胞分别加入含不同浓度NaF(0、8、12、16和20μg/ml)的无血清的培养基,培养2h后,提取RNA,使用实时定量PCR仪测定各个浓度组NaF对mLTC-1细胞StAR和P450scc mRNA的表达。
结果：
1.根据生长曲线可知,体外培养的mLTC-1细胞在4d,细胞的活性最强,代谢旺盛。
2.mLTC-1细胞培养基上清中孕酮的分泌量:给予HCG刺激后,mLTC-1细胞分泌孕酮量随HCG浓度的增加而增加,在10IU/ml时,其分泌量进入平台期,故选择该浓度作为HCG最佳刺激浓度。
3.mLTC-1细胞中StAR和P450scc mRNA表达水平:12μg/ml、16μg/ml、20μg/ml NaF浓度组的StAR和P450 mRNA的达量比对照组这两个基因表达量低,且差异有统计学意义(P<0.05)。
结论：
在mLTC-1细胞活性没有明显改变的情况下,NaF可以抑NStAR和P450sccmRNA的表达而影响mLTC-1细胞睾酮的合成,提示NaF可能是通过影响StAR和P450scc基因的表达而影响mLTC-1细胞合成睾酮的。