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【目的】吡咯烷生物碱（Pyrrolizidine alkaloids,PAs）所导致的肝窦阻塞综合征（Hepatic sinus obstruction syndrome,HSOS）目前临床上暂无明确治疗方法。既往回顾性研究结果表明,抗凝治疗被推荐成为临床实践中PAs诱导HSOS的一种治疗策略。本文旨在证实抗凝治疗在动物模型的疗效,并探索其潜在的治疗机制。【方法】1回顾性分析依诺肝素对PAs-HSOS患者的预后影响1.1评估患者入院临床特征基线本研究共纳入2003年11月至2021年1月就诊于武汉协和医院（中国,武汉）的91例PAs-HSOS患者。其中抗凝组（依诺肝素（Enoxaparin）或者达肝素钠（Dalteparin））11例和对症支持组80例。收集患者症状、体征、病史,入院初次检查指标（主要包括:血常规、肝肾功能、凝血指标等基本结果,并对患者肝功能进行Child/Meld评分）。比较两组患者入院起始临床特点。1.2随访评估两组患者远期预后在患者结束住院治疗出院后,对患者进行为期至少1年的随访以评估远期治疗效果。随访时间定义为从纳入到死亡、失访或研究结束为止。2制备大鼠、小鼠的MCT-HSOS动物模型,并研究依诺肝素对MCT-HSOS模型疗效。2.1大鼠MCT-HSOS的动物模型采用野百合碱（Monocrotaline,MCT 90mg/kg）单次灌胃干预大鼠,24h造模后统一处死并且收集动物肝脏标本,检测分离后血清样本中ALT、AST以及ALB的表达情况,肝脏外观、H＆E染色及损伤面积统计、HSOS严重度评分评估组织学改变,记录生存率。2.2依诺肝素对于大鼠MCT-HSOS模型疗效探索。制备成功的大鼠MCT-HSOS模型,造模后使用不同剂量的依诺肝素（0、2.5、8mg/kg,sc,qd）进行干预治疗,连续治疗1周后予以处死。收集肝脏样本,通过对比不同浓度的大鼠病理结果及组织学评分,选择最佳干预剂量8mg/kg,检测指标同2.1。2.3小鼠MCT-HSOS的动物模型探索采用200、400、600、800mg/kg浓度梯度的MCT单次灌胃处理制备小鼠MCT-HSOS模型,分别在处理24h、48h、72h后处死。收集各组肝脏样本,通过对比不同浓度、处理时间的小鼠病理结果及组织学评分,最终确定700mg/kg,24h作为最佳造模浓度及最佳成模时间,检测指标同2.1。2.4依诺肝素对于小鼠MCT-HSOS模型疗效探索。制备成功的小鼠MCT-HSOS模型,造模24h后使用不同浓度的依诺肝素（0、15、40、100mg/kg,sc,q12h）进行干预治疗,连续治疗4-6次后处死,对比各组小鼠HE染色结果并进行组织学评分,选择最佳干预剂量40mg/kg,检测指标同2.1。3结合二代测序和基因表达检测技术筛选依诺肝素治疗MCT-HSOS小鼠前后基因改变并验证利用二代测序技术分析依诺肝素治疗MCT-HSOS小鼠前后及正常对照组基因变化,筛选出Osm靶基因。随后对测序筛选结果进行RT-PCR、IHC验证,同时与CD3（T细胞标记物）、F4/80（巨噬细胞标记物）、HNF4α（肝细胞标记物）荧光共染明确靶基因具体表达位置。4构建肝细胞特异性Osm敲除小鼠,评估MCT诱导的肝细胞特异性Osm敲除小鼠模型肝损伤及依诺肝素疗效通过将AAV8-TBG-Cre注入Osmflox/flox构建肝细胞特异性Osm敲除小鼠,采用MCT（700mg/kg）单次灌胃干预Osm△Hep和Osmflox/flox小鼠,24h后采用依诺肝素（40mg/kg,sc,q12h）或等量生理盐水进行干预治疗,连续治疗4-6次后处死。收集肝脏样本,检测血清ALT、AST和ALB表达水平,肝脏外观、H＆E染色及损伤面积统计、HSOS严重度评分、电镜评估组织学改变。5构建Osm过表达小鼠,评估依诺肝素对MCT诱导的Osm过表达小鼠MCT-HSOS模型疗效将制备成功的小鼠MCT-HSOS（700mg/kg）模型随机分为两组,造模16h后两组分别予以尾静脉注射腺病毒（Ad-Osm、Ad-Null,3*10~8/只）。腺病毒注射2h后两组均进行依诺肝素（40mg/kg,sc,q12h）治疗,4-6次后处死。收集肝脏样本,检测指标同4。6评估依诺肝素与Osm之间的联系将小鼠正常肝细胞系的密度调至2*10~5个细胞/孔,然后均匀的接种到24孔板中。用嵌合Osm启动子-荧光素酶报告基因构建体转染小鼠正常肝细胞24h。此后将无血清培养基添加到含有或不含所示浓度的α-凝血酶的孔中,并将细胞在37°C下孵育24h,孵育结束后收集24孔板中的细胞裂解液,利用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测（Promega）。【结果】1、回顾性收集的91例患者（对症支持组80例、抗凝组11例）入院初次临床基线相近,院外随访显示对症支持组患者生存率仅为60.00%,而抗凝组患者生存率为90.90%,差异存在统计学意义（p=0.031）。2、90mg/kg MCT灌胃制备的大鼠MCT-HSOS模型为可重复模型,依诺肝素（8mg/kg,sc,qd）连续治疗7天浓度的效果最佳。3、700mg/kg MCT灌胃制备的小鼠MCT-HSOS模型24h后可成模,依诺肝素（40mg/kg,sc,q12h）连续治疗4-6次的效果最佳。4、Osm△Hep小鼠的MCT-HSOS模型肝损伤明显减轻,依诺肝素治疗前后,肝损伤情况无明显差别。5、Ad-Osm小鼠的MCT-HSOS模型则由于外源性Osm在肝细胞的预先积累,依诺肝素的治疗作用则收效甚微。6、即使无外界损伤打击,凝血酶干预后肝细胞中的Osm依然可以小幅表达升高。【结论】本研究发现的结果提供了充足的证据:首先Osm是PAs-HSOS诱导肝损伤的潜在靶点。抗凝治疗可通过抑制PAs-HSOS中肝细胞内异常表达的Osm来减轻肝脏损伤。本研究了抗凝治疗的机制并为其临床应用提供了理论依据。