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目的:研究细胞色素P450 1A1(CYP1A1)对脂多糖(LPS)诱导的活化巨噬细胞中一氧化氮的生成的影响。方法:1.取10只野生型C57BL/6小鼠,提取并体外培养其原代腹腔巨噬细胞(Peritoneal Macrophages,PMs),分为LPS 0h对照组、LPS 2h组、LPS 6h组、LPS 12h组(LPS终浓度为10mg/L),采用实时荧光定量PCR(Real Time quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)检测PMs中CYP1A1的基因表达情况,采用蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测PMs中CYP1A1蛋白的表达情况。探究CYP1A1在LPS诱导的炎性巨噬细胞中的变化。2.构建CYP1A1过表达、表达阴性对照载体的RAW264.7细胞株,分为CYP1A1/RAW组及NC/RAW组,通过倒置荧光显微镜检测增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)的表达情况,采用RT-q PCR和WB法验证CYP1A1基因及蛋白是否过表达。3.体外培养CYP1A1过表达、表达阴性对照载体的小鼠巨噬细胞株RAW264.7(分别简写为CYP1A1/RAW、NC/RAW),分为CYP1A1/RAW+LPS组、NC/RAW+LPS组、CYP1A1/RAW+PBS组、NC/RAW+PBS组,分别用LPS(LPS终浓度为10mg/L)及等体积PBS刺激上述细胞,采用RT-q PCR检测上述细胞中i NOS的基因表达情况,采用Griess法检测细胞培养上清中一氧化氮(Nitric Oxide,NO)的水平,采用WB检测诱导型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase,i NOS)蛋白表达以及激活蛋白-1(Activator Protein-1,AP-1)磷酸化水平情况。探究CYP1A1对LPS诱导巨噬细胞生成NO的影响作用。4.取小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞传代培养,分为单独LPS刺激组(LPS终浓度为10mg/L)、单独12(S)-羟基二十碳四烯酸[12(S)-Hydroxyeicosatetraenoic acid,12(S)-HETE]刺激组[12(S)-HETE终浓度为100 nmol/L]、LPS+12(S)-HETE刺激组以及空白对照组,采用RT-q PCR检测上述组别细胞中i NOS的m RNA表达,采用Griess法检测细胞培养上清中NO含量,观察CYP1A1对LPS诱导巨噬细胞生成NO的影响是否与12(S)-HETE有关。5.构建并鉴定过表达CYP1A1基因且突变CYP1A1羟化酶活性位点的RAW264.7细胞株(CYP1A1mutant/RAW简写为CYP1A1m/RAW)。体外培养CYP1A1/RAW及CYP1A1m/RAW细胞,将其分为CYP1A1m/RAW+LPS组、CYP1A1/RAW+LPS组、CYP1A1m/RAW空白组、CYP1A1/RAW空白组,分别给予或不给予LPS(LPS终浓度为10mg/L)刺激,完毕后检测细胞中i NOS的m RNA表达及细胞培养上清中NO含量。观察CYP1A1羟化酶活性是否参与其对LPS诱导巨噬细胞中NO生成的调控。结果:1.与LPS 0h对照组比较,LPS 6h及12h组PMs细胞中CYP1A1 m RNA表达显著升高,CYP1A1的蛋白水平也相应增强,说明LPS诱导的活化巨噬细胞中CYP1A1表达水平明显上调。2.获得稳定过表达CYP1A1的RAW264.7细胞株后,用倒置荧光显微镜观察显示转染成功,同时RT-q PCR和WB的检测结果表明,在相同的时间点,与NC/RAW组细胞相比,CYP1A1/RAW组细胞的CYP1A1 m RNA和蛋白水平均显著升高。3.与NC/RAW+LPS组相比,CYP1A1/RAW+LPS组细胞中i NOS m RNA的表达水平及NO的生成水平均显著增加,与此同时,细胞中AP-1磷酸化水平和i NOS蛋白水平也显著增强,提示CYP1A1可能通过活化AP-1/i NOS通路以促进NO的生成。4.单独给予LPS或LPS联合12(S)-HETE刺激RAW264.7细胞株后,与单独LPS刺激组相比,LPS+12(S)-HETE刺激组细胞中i NOS的m RNA表达和NO的生成并无统计学差异,说明CYP1A1对巨噬细胞生成NO的调控作用与其致炎代谢产物12(S)-HETE无关。5.CYP1A1m/RAW细胞较CYP1A1/RAW细胞中CYP1A1羟化酶活性显著降低,与CYP1A1/RAW+LPS组相比,CYP1A1m/RAW+LPS组中i NOS的m RNA表达及NO的生成无显著差异,说明CYP1A1对NO的调控也不是通过其羟化酶活性而实现。结论:1.LPS可使巨噬细胞中CYP1A1表达水平显著上调。2.CYP1A1过表达可能通过AP-1/i NOS通路促进LPS诱导时巨噬细胞中NO的生成。3.CYP1A1对于巨噬细胞生成NO的调控作用与CYP1A1羟化酶活性及其致炎代谢产物12(S)-HETE无关。