【摘 要】
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谷胱甘肽硫转移酶A3（GSTA3）作为GSTs超家族中α家族的一员,具有解毒功能,参与抗氧化应激调节,是人类已知催化效率最高的类固醇异构酶,在肉鸡胫骨软骨发育不良的治疗方面也扮演着十分重要的角色。本研究通过克隆编码GSTA3蛋白的基因,构建pGEX-6P-1-Gsta3原核表达载体,诱导并纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔获得GSTA3多克隆抗体。为GSTA3蛋白功能与结构的研究奠定基础。本试验从鸡组
【基金项目】
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国家重点研发计划（2016YFD0500800）； 中美新发和再发传染病合作项目（E090090201-3）；
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谷胱甘肽硫转移酶A3（GSTA3）作为GSTs超家族中α家族的一员,具有解毒功能,参与抗氧化应激调节,是人类已知催化效率最高的类固醇异构酶,在肉鸡胫骨软骨发育不良的治疗方面也扮演着十分重要的角色。本研究通过克隆编码GSTA3蛋白的基因,构建pGEX-6P-1-Gsta3原核表达载体,诱导并纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔获得GSTA3多克隆抗体。为GSTA3蛋白功能与结构的研究奠定基础。本试验从鸡组织中提取总RNA,反转录成c DNA后,设计特异性引物通过PCR技术以c DNA为模板扩增鸡Gsta3基因,并将Gsta3目的片段连接至T Vector p MD19（Simple）载体,构建重组质粒p MD19-T-Gsta3;本试验选用pGEX-6P-1质粒和p Cold-TF质粒构建pGEX-6P-1-Gsta3、p Cold-TF-Gsta3两个不同标签的原核表达载体。经测序验证,转入感受态细胞E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达融合蛋白,亲和层析法纯化融合蛋白分别命名为GST-GSTA3、His-GSTA3;将纯化的GST-GSTA3蛋白与弗氏佐剂充分乳化后作为免疫原,采用背部皮下多点注射的方式免疫雌性新西兰大白兔,获得GSTA3多克隆抗体。His-GSTA3蛋白作为间接ELISA方法中的包被抗原,用棋盘滴定法确定最佳包被浓度后,检测和筛选抗鸡GSTA3蛋白的多克隆抗体。蛋白免疫印迹（WB）和间接免疫荧光实验（IFA）确定抗体对GSTA3蛋白的特异性。经检测,抗体效价为1︰102400,成功制备出兔抗鸡GSTA3多克隆抗体;Western Blot确定制备的兔抗鸡GSTA3多抗血清对GSTA3蛋白有良好的反应性。IFA表明抗血清能特异性识别鸡成纤维细胞GSTA3蛋白。
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