【摘 要】
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目前,肿瘤的靶向治疗发展迅速,靶向药物研究更为深入。在抗体介导的融合蛋白靶向治疗研究领域,课题组前期构建了由抗HER2（人表皮生长因子受体2）单链抗体、膜转位结构域、人凋亡效应蛋白依次连接组成的免疫促凋亡分子,能够特异性地直接诱导肿瘤凋亡。然而这一蛋白要投入转化,仍需解决两个问题:（1）如何进一步降低在动物体内的治疗剂量;（2）如何进一步加大治疗间隔,降低给药频率。对于第一点,本论文将肿瘤的杀伤策
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目前,肿瘤的靶向治疗发展迅速,靶向药物研究更为深入。在抗体介导的融合蛋白靶向治疗研究领域,课题组前期构建了由抗HER2（人表皮生长因子受体2）单链抗体、膜转位结构域、人凋亡效应蛋白依次连接组成的免疫促凋亡分子,能够特异性地直接诱导肿瘤凋亡。然而这一蛋白要投入转化,仍需解决两个问题:（1）如何进一步降低在动物体内的治疗剂量;（2）如何进一步加大治疗间隔,降低给药频率。对于第一点,本论文将肿瘤的杀伤策略升级为免疫促焦亡策略,即将凋亡效应分子t Bid更换为发挥作用更快的焦亡效应分子GSDMD-N（GN）,构建获得新型免疫促焦亡分子。对于第二点,将构建的分子进行长效化改构,在单链抗体和膜转位结构域之间加入一段白蛋白结合肽（ABD035或d Ab7h8）,并以相同位置插入Ig G（免疫球蛋白G）的Fc段作为长效化阳性对照,构建获得长效化免疫促焦亡分子,由于白蛋白结合肽能与血清白蛋白结合,因而可以延长免疫促焦亡分子的血清半衰期,从而延长其发挥肿瘤杀伤作用的时间。研究结果如下:1.构建了3种新型长效化免疫促焦亡基因,以及用作对照的长效化免疫促凋亡基因、免疫促焦亡基因和免疫促凋亡基因,并验证了这些重组基因的表达。2.选取构建好的4种分子:长效化免疫促焦亡分子p LVX-P1h3-ABD-GN、p LVX-P1h3-78-GN,免疫促焦亡分子p LVX-P1h3-GN以及免疫促凋亡分子p LVX-P1h3-t Bid,通过慢病毒包装后感染Jurkat细胞,构建基因修饰Jurkat细胞,检测其对肿瘤细胞的体外杀伤活性。结果表明,分泌长效化免疫促焦亡蛋白P1h3-ABD-GN及免疫促凋亡蛋白P1h3-t Bid的Jurkat细胞对HER2阳性肿瘤细胞均具有杀伤作用,且前者的杀伤作用强于后者,这说明长效化免疫促焦亡分子的杀伤作用强于免疫促凋亡分子,并且采用细胞分泌这一策略是可行的。3.通过将人外周血分离、阴选及活化后得到CD3阳性T细胞,再构建基因修饰T细胞,检测其对肿瘤细胞的体外杀伤活性。结果表明,分泌P1h3-ABD-GN和P1h3-Fc-GN、P1h3-Fc-t Bid以及P1h3-t Bid的T细胞均能够靶向HER2,对HER2阳性肿瘤细胞N87及SKBR3均具有杀伤作用。其中长效化免疫促焦亡分子P1h3-ABD-GN和免疫促凋亡分子P1h3-t Bid杀伤作用更明显,且前者的杀伤作用强于后者,这说明长效化免疫促焦亡分子的杀伤作用强于免疫促凋亡分子,同时进一步支持了细胞分泌治疗策略的临床应用可行性。4.选取HER2阳性胃癌细胞N87,建立了异种移植瘤Balb/c裸鼠模型,通过尾静脉注射分泌P1h3-ABD-GN、P1h3-GN和P1h3-t Bid的Jurkat细胞对其进行治疗。结果表明,在N87小鼠胃癌皮下瘤模型中,长效化免疫促焦亡分子在体抑制肿瘤生长的能力更强,这与体外实验趋势相同。同时在治疗结束后进行了免疫组化及TUNEL染色验证,结果表明本策略对HER2阳性肿瘤有良好的靶向性,且长效化免疫促焦亡蛋白在肿瘤组织内的聚集更多,提示其白蛋白结合肽使得分泌的蛋白发挥作用时间更长,故诱导肿瘤细胞死亡的作用也更强。结论:长效化免疫促焦亡分子能够在体外及体内杀伤HER2阳性肿瘤细胞,这一杀伤作用强于免疫促焦亡分子,也强于免疫促凋亡分子,证实了诱导细胞焦亡比诱导细胞凋亡更有效,并且加入的白蛋白结合肽能够使分泌的蛋白发挥作用时间更长。
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