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抗生素是水产养殖常用的细菌性病害防治药物,但是随着近年来耐药性的产生,使得抗生素的防治效果越来越差,给人类健康和食品安全带来巨大的风险。因此,寻找高效、安全的抗菌药物成为新的研究目标和热点。鼠李糖脂是一种同时具有亲水基和疏水基的生物表面活性剂,其具有良好的乳化、降低表界面张力、无毒易降解和抗菌等性能,可广泛应用于石油、食品、农业和医疗等行业,具有广泛的应用前景。本研究的目的是筛选一株高效抗菌鼠李糖脂产生菌株,为鼠李糖脂开发成为应用于水产养殖的抗菌制剂提供理论和技术支持。1鼠李糖脂菌株筛选技术的改进与高产鼠李糖脂产生菌株的筛选本课题从餐饮油污土壤中通过富集培养和梯度稀释平板法分离得到325株菌,其中有11株菌在CTAB平板上产生颜色反应;4株菌具有良好的乳化性,菌株A39-1的乳化指数可达70.8±1.49%;6株菌具有良好的排油性,菌株A39-1的排油性最大为60.81±0.64 mm,发酵液中鼠李糖脂浓度为8.46 g/L;硫酸-蒽酮实验和酸沉实验验证6株菌的发酵液中存在糖脂和脂肽类表面活性剂;通过薄层色谱实验及结合上述实验证实菌株A10、A11、A39-1、A39-2、A40-1和A40-2能够产鼠李糖脂。最后经过形态特征和16r RNA等方面的分析,鉴定菌株A10鉴定为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）,菌株A11、A40-1鉴定为苯丙酮假单胞菌（Pseudomonas benzenivorans）,菌株A39-1鉴定为门多撒假单胞菌（Pseudomonas mendocina）、菌株A39-2鉴定为硝基还原假单胞菌（Pseudomonas nitroreducens）、菌株A40-2为黄褐假单胞菌（Pseudomonas fulva）。本研究将传统的CTAB平板法与打孔法结合,并对原有筛菌的技术路径进行修改,先进行菌株发酵再用改进的CTAB平板法筛选产鼠李糖脂菌株,扩大了菌株的筛选范围,共筛选得到6株产鼠李糖脂菌株,均为首次发现产鼠李糖脂菌株,国内外尚未有报道,其中菌株A39-1门多萨假单胞菌产率最高为8.11 g/L。改进的筛菌技术提高了筛选鼠李糖脂菌株的效率,为鼠李糖脂菌株的快速筛选提供了可借鉴的技术。从餐饮油污土壤中筛选得到6株产鼠李糖脂菌株,为餐饮废油的回收利用并作为发酵产鼠李糖脂的碳源提供理论依据。2.鼠李糖脂的抗菌性能与机制初步研究本课题初步探究了6株产鼠李糖脂菌株对水产上常见4株病原菌的抗菌性能和机制。牛津杯法测得菌株A39-1发酵产物鼠李糖脂对水产上常见4株病原菌具有良好的抑菌效果,结果显示,对副溶血弧菌、哈维氏弧菌、无乳链球菌和荧光铜绿假单胞菌最小抑菌浓度（MIC）分别为:15.63 mg/L,7.8mg/L,7.8 mg/L,7.8 mg/L。通过结晶紫染色法研究了鼠李糖脂对生物膜预形成的影响,结果显示:随着鼠李糖脂的浓度逐渐接近MIC浓度,细菌生物膜的形成率就越低。当鼠李糖脂浓度达到6 mg/L时,其对副溶血弧菌和无乳链球菌的生物膜形成开始产生强烈的抑制效果,继续增加鼠李糖脂浓度对细菌生物膜抑制效果减弱;当鼠李糖脂浓度达到4 mg/L时,其对哈维氏弧菌和荧光铜绿假单胞菌的生物膜形成开始产生强烈的抑制效果,继续增加鼠李糖脂浓度对哈维氏弧菌生物膜的抑制效果减弱。通过结晶紫染色法研究了鼠李糖脂对已形成生物膜的影响,结果显示:除了哈维氏弧菌,鼠李糖脂对副溶血弧菌、无乳链球菌和荧光铜绿假单胞菌已形成的生物膜具有强烈的破坏效果,其中对副溶血弧菌生物膜破坏效果最显著,当鼠李糖脂浓度为8 mg/L时,副溶血弧菌的生物膜形成率达到最低为10.3±2.11%。鼠李糖脂对哈维氏弧菌已形成的生物膜破坏效果最差,当鼠李糖脂浓度为6 mg/L时,生物膜形成率高达75.5±1.14%。实验结果表明,鼠李糖脂具有良好的抗菌性能,开发成为抗菌制剂应用于水产养殖具有重大意义。菌株A39-1门多萨假单胞菌为首次发现产鼠李糖脂,具有高效的抗菌性能,国内外尚未有报道,生物安全等级为:四级。3.产鼠李糖脂菌株A39-1门多萨假单胞菌发酵参数的优化本研究采用单因素法和响应面法优化菌株A39-1的发酵培养基成分及发酵条件。在摇瓶发酵条件下,采用单因素法筛选菌株A39-1的最佳发酵培养基组分和培养条件,并确定影响菌株发酵产鼠李糖脂的7个主要影响因素。根据PB设计试验结果,选出影响鼠李糖脂产量的3个最显著因素,并采用最陡爬坡路径法确定3个因素的响应中心点和最佳浓度范围。最后,通过BoxBehnken设计和响应面分析获得最佳培养基配方。优化结果表明,菌株A39-1门多萨假单胞菌的最佳培养基和最适发酵条件:葵花籽油50 g/L、硝酸钠12.15 g/L、磷酸二氢钾+磷酸氢二钠6 g/L、硫酸镁0.48 g/L、氯化钙0.05 g/L、微量元素2 mL/L、p H 6.8、温度37℃和转速186.07 r/min。本研究从餐饮油污土壤中筛选得到6株产鼠李糖脂菌株,其中菌株A39-1门多撒假单胞菌为首次发现可以产鼠李糖脂,具有良好的抗菌性能,国内外尚未有报道,改进的CTAB平板法有助于菌株的筛选,扩大了菌株的筛选范围。初步探究了鼠李糖脂对4种病原菌抗菌作用机制并通过培养基组分和培养条件优化,菌株A39-1产鼠李糖脂产量提高了9倍,实测鼠李糖脂浓度为72.84 g/L。相比较优化之前鼠李糖脂产量8.11 g/L,经优化后的鼠李糖脂产量较优化前提高了9倍。