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目的：1．探测人类头颈鳞癌细胞中可能存在的离子通道；2．探讨离子通道与人类头颈鳞癌细胞生长和增生的关系；3．探讨离子通道阻断剂及特异性RNA干扰对人类头颈鳞癌细胞生长和增生的影响。
方法：1．细胞株的选择：本研究选用一种常用的头颈鳞癌细胞株-FaDu细胞株；2．电生理实验：全部实验采用全细胞电压钳记录模式，Axopatch 200B放大器及pCLAMP软件用于记录和初步分析FaDu细胞株的全细胞电流。SF-77型多通道灌流系统被用于获取快速的液体交换。所有实验均在常规室温下进行(22-24℃)；3．免疫组织化学：TRPM7第一抗体采用1：100稀释度，第二抗体选用1：750稀释度Cy3偶联的山羊抗兔抗血清，DAPI染色液用于对胞核进行染色；4．Western印迹：FaDu细胞株在25cm<2>细胞培养瓶中生长3-5天、经过TRPM7转染的人胚肾细胞(human embryo kidney，HEK293)在转染24-48小时后用于进行Western免疫印迹检测。TRPM7第一抗体工作浓度为1：200，辣根过氧化物酶偶联的第二抗体工作浓度为1：1000。β-actin(β-肌动蛋白)用作本实验的内对照；5．RT-PCR：细胞总RNA提取采用RNeasy Mini试剂盒，合成cDNA模板采用SuperScript Ⅱ RT试剂盒，PCR扩增采用Advantage PCR试剂盒。3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为本实验的内对照，超纯净水代替cDNA模板用作阴性对照；6．siRNA基因沉默：pSilencer 1.0-U6用于构建表达TRPM-siRNA的载体，pCAGGS-eGFP质粒用来同时表达增强的绿色荧光蛋白和短发夹状RNA。细胞转染采用Fugene6转染试剂盒。未经插入寡核苷酸而直接从pSilencer 1.0-U6 siRNA表达载体切割下来的片断，插入pCAGGS-eGFP质粒用作本实验的阴性对照。Silencer siRNA转染试剂盒用于研究TRPM7-siRNA与细胞增生的关系；7．Ca<2+>成像：FaDu细胞载入fura-2钙荧光探针后，其数字化图像及340/380nm比值经由Axon图像分析软件收集、储存、分析并传送至SigmaPlot8.0软件作图；8.细胞计数和乳酸脱氢酶释放试验：将预稀释的细胞悬液接种于24孔板内，使每孔内均含有10<5>个细胞。生长72小时后通过细胞计数板计算出每孔的细胞总数。乳酸脱氢酶(LDH assay)实验采用细胞毒性检测试剂盒进行；9.电生理学实验中的液体和化合物：细胞外液分别选用标准细胞外液及不含二价离子的细胞外液；电极内液则选用标准电极内液及不含镁离子的电极内液。电生理实验中的化合物大都购自Sigma公司；10.统计学分析：配对或非配对t检验以及方差分析用于数据的统计学显著性分析。
结果：1.降低细胞外液钙离子浓度在FaDu细胞株诱导出一种缓慢不失活的内向电流；2.药理学结果表明从FaDu细胞株记录到的钙敏感内向电流类似TRPM7电流；3.免疫组织化学及Western免疫印迹均检测到在FaDu细胞株中存在TRPM7蛋白，RT-PCR检测结果表明FaDu细胞株中存在TRPM7 mRNA；4.TRPM7-siRNA能选择性地抑制FaDu细胞株中类TRPM7电流，同时抑制FaDu细胞株中TRPM7蛋白及mRNA的表达；5FaDu细胞株Ca<2+>成像实验显示在细胞外液钙离子浓度从0mM到2mM的范围内，细胞内液的钙离子浓度随细胞外液钙离子浓度上升而上升。进一步研究揭示在此Ca<2+>浓度范围内，细胞的增生速率与培养基中钙离子浓度的高低呈正比，当培养基中不含钙离子时，FaDu细胞生长完全停止；6无论是细胞计数结果还是乳酸脱氢酶释放试验结果均显示TRPM7-siRNA能显著降低FaDu细胞的生长速率，而阴性对照siRNA则不影响细胞的生长。
结论：
1.电生理学研究结果表明从天然FaDu细胞株记录到的钙敏感内向电流属于类TRPM7电流。
2.分子生物学实验结果证实天然FaDu细胞株中存在TRPM7通道。
3．FaDu细胞中存在的TRPM7通道可能在提供胞外钙离子进入胞内的过程中起着十分重要的作用，从而直接影响到FaDu细胞的生长和增生过程。
4．离子通道阻断剂Gd<3+>、2-APB及特异性RNA干扰对人类头颈鳞癌细胞生长和增生具有明显的抑制作用。
5．2-APB对人类头颈鳞癌细胞生长和增生的强大抑制作用可能为将来临床上治疗头颈鳞癌患者展现了一个广阔而诱人的前景。