论文部分内容阅读
地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）B5102是我国自主开发的碱性蛋白酶生产菌株，其产品在我国皮革加工等行业有广泛的应用。本文以B. licheniformis B5102及其碱性蛋白酶基因为基础构建重组菌，获得碱性蛋白酶产量显著提高或发酵周期显著缩短的重组菌，并针对重组菌建立了相应的25L发酵罐发酵工艺。1.根据已公布的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因序列，设计引物，用PCR方法扩增获得碱性蛋白酶生产菌B. licheniformis B5102的碱性蛋白酶基因apr。将该基因片段与质粒pLY连接，转化枯草芽孢杆菌WB600。从重组枯草芽孢杆菌中提取重组质粒后进行DNA序列分析。结果发现，重组质粒在pLY的BamHI位点处插入了1.8kb的完整apr基因，其中包含1140bp的开放阅读框和完整的上下游调控区（GenBank登录号为JQ285995）。该基因序列与B. licheniformis ATCC14580碱性蛋白酶基因同源性最高，仅有两个碱基差异，酪素平板检测和摇瓶发酵均显示重组菌B. subtilis WB600/pLY-apr可以成功分泌表达碱性蛋白酶。SDS-PAGE电泳显示，重组酶表观分子量大约为31kDa。2.以重组质粒pLY-apr电转化解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciens B4803筛选获得碱性蛋白酶高产重组菌一株，命名为B. amyloliquefaciens B4803/pLY-apr。B.amyloliquefaciens B4803/pLY-apr摇瓶发酵酶活达到5122u/mL。与碱性蛋白酶生产菌B.licheniformis B5102相比，重组菌B. amyloliquefaciens B4803/pLY-apr摇瓶发酵时间缩短了32h，只需68h，发酵酶活提高46%。在25L发酵罐中，重组菌B. amyoliquefaciensB4803/pLY-apr发酵时间为60h，比B. licheniformis B5102发酵时间缩短36h，达到发酵终点时重组菌酶活水平为9847u/mL，与B. licheniformis B5102发酵水平接近。3.重组质粒pLY-apr转化地衣芽孢杆菌B5102，筛选获得碱性蛋白酶重组菌命名为B. licheniformis B5102/pLY-apr。B. licheniformis B5102/pLY-apr摇瓶发酵最高酶活达到5477u/mL，而相同条件下出发菌B. licheniformis B5102发酵酶活为3505u/mL。在25L发酵罐上， B. licheniformis B5102/pLY-apr发酵酶活达到14713u/mL，出发菌碱性蛋白酶发酵酶活为9658u/mL，重组菌的产酶水平比后者提高了52.3%。4.优化了重组菌B. licheniformis B5102/pLY-apr的摇瓶发酵条件。优化后的培养基组分为：木糖80g/L，豆饼粉45g/L，氯化铵3g/L，磷酸盐15mmol/L，氯化钙0.2g/L。在优化条件下重组菌摇瓶产碱性蛋白酶酶活最高达8375u/mL，比优化前提高了53%左右。在25L发酵罐上，B. licheniformis B5102/pLY-apr发酵最高酶活达到26500u/mL，比优化前提高了80%，发酵时间为104h。5.对重组菌B. licheniformis B5102/pLY-apr表达的碱性蛋白酶进行酶学性质分析，其最适作用温度为50℃、最适pH为9.5，且在50℃、pH8-11的条件下表现出良好的稳定性。