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[目 的]NK细胞是天然免疫的主要载体,是获得性免疫的核心调节细胞,在抗感染、抗肿瘤、清除外来细胞等方面发挥着重要作用。过继性免疫疗法由于具备清除体内残留肿瘤细胞及减少因放、化疗所致的机体免疫功能受损的优势,并与常规三大疗法联合治疗肿瘤的策略获得的显著疗效的逐步显现,使过继性免疫细胞疗法成为十分有前景的免疫治疗选择。为了使过继性免疫治疗得到更广泛的应用,从不同来源的NK细胞中选择并制备出更优良的NK细胞产品成为当前研究热点。本研究目的（1）人脐带血来源的单个核细胞（human umbilical cord blood-derived mononuclear cell,hUC-MNC）在 Miltenyi 和 Lonza X-vivo 15 体外培养体系下活化扩增后的不同人脐带血自然杀伤细胞（hUC-NK）亚群的免疫表型及细胞毒性等功能水平的评估及比较。（2）人骨髓来源的单个核细胞（human bone marrow-derived mononuclear cell,hBM-MNC）和脐带血来源的单个核细胞（human umbilical cord blood-derived mononuclear cell,hUC-MNC）在体外进行扩增活化,获得的NK细胞及其亚群的免疫表型及细胞毒性等功能的水平进行评估及比较。[方 法]（1）收集健康产妇供者捐赠的脐带血,提取单个核细胞,选择使用Miltenyi和Lonza X-vivo 15体外培养体系联合3因子策略（IL-2、IL-15、IL-18,定义为“3IL”）,诱导培养14 d产生人脐带血NK细胞,对两种hUC-NK细胞（分别定义为M-NK和X-NK）进行形态学观察及记录,并使用流式细胞学检测NK细胞及其细胞亚群的分布。同时通过计数NK细胞增殖数量评估细胞活力,并进行与经典肿瘤细胞系K562细胞共培养来检测NK细胞的杀伤功能,从而评估2种体系对NK细胞在生物学特性和功能等方面的影响。（2）无菌采集供者捐赠的骨髓血及健康孕产妇的脐带血,使用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,利用Miltenyi体外培养策略联合3因子体系（“3IL”）,对不同来源的NK细胞进行体外诱导扩增活化。在细胞周期内的不同时间点,对骨髓NK细胞（hBM-NK）和脐带血NK细胞（hUC-NK）进行形态观察、增殖活力及能力检测,使用流式细胞术分别检测、比较激活后的NK细胞（expandedNK,定义为eNK）的免疫表型及功能,同时与多个肿瘤细胞系共培养进一步评价其细胞毒性。[结 果]本文使用以上研究方法进行实验后得到如下研究结果:（1）在此项研究中,通过采用Miltenyi和Lonza X-vivo 15两种体外培养策略诱导NK细胞1个细胞培养周期之后,总CD3-CD56+NK细胞比例均可由第0天的 4.25±0.07%提高至第 14 天的 71±0.18%（M-NK）和 75.2±1.9%（X-NK）左右。相较于M-NK组,X-NK组中T细胞亚群（CD3+CD4+T和CD3+CD56+NKT）细胞比例分布较高,且其细胞表面表达CD16、NKG2D、NKp44、CD25的活化型NK细胞的占比更多。虽然两组均能够不同程度的促进hUC-NK细胞的增殖,但M-NK组在增殖能力上明显具有一定优势,其扩增后数量和倍数可达X-NK组的2倍。在细胞活力方面,二者细胞周期无显著统计学差异,但M-NK组中Annexin V+凋亡细胞较少。通过两种体系诱导的hUC-NK细胞与K562细胞系在胞以效靶比（E:T）为1:1、1:5和1:10的比例共培养6h进行体外杀伤后结果分析,在相同效靶比（E:T）下,M-NK组明显上调了其NK细胞表面CD107a的表达,同时杀伤后体系中残留肿瘤活细胞数更少,杀伤效率更优于X-NK。（2）在采用Miltenyi NK细胞培养体系联合“3IL”培养BM-NK及UC-NK细胞14天后,eUC-NK的CD3-CD56+NK细胞的扩增能力更显著;且随着NK细胞的扩增,CD3+CD56+NKT细胞比例亦逐步增加,而总CD3+T细胞及其亚群CD4+T细胞显著降低。与Day0 NK细胞相较,几乎所有NK细胞亚群被活化,且其表面标记物的表达均有显著增加。eBM-NK与eUC-NK细胞表面CD16、NKG2D和NKp46表达比例相近,无统计学差异;eBM-NK细胞表面的NKp44表达上调幅度更明显,但eUC-NK获得CD25+记忆性NK细胞比例更多。在细胞活性方面,eBM-NK和eUC-NK细胞处于凋亡状态的细胞较少，无统计学差异;eUC-NK细胞进入有丝分裂期（G2/M期）的比例更多,增殖能力相对较强,但二者在体外14天后增殖能力呈现逐渐减弱趋势。通过使eBM-NK和eUC-NK细胞分别与K562、Nalm6、U937肿瘤细胞系在效靶比为1:5的比例下共培养6h进行体外杀伤实验结果发现,体系中NK细胞表面标志CD107a的表达量均明显增加,eBM-NK较为显著;且体系中eBM-NK组残留肿瘤细胞更少,其杀伤能力更具优势。[结 论]（1）在采用Miltenyi和Lonza X-vivo 15两种体外扩增活化策略均可高效诱导出增殖能力较强的hUC-NK,并提高了其活化水平及细胞毒性能力。通过多方面的研究分析,M-NK组在增殖及增强细胞毒活性方面具有一定优势,而X-NK组更有效能促进细胞活化,获得较多高活性的NK细胞。结果表明二者在生物学表型和肿瘤杀伤活性等多个方面存在异同,可为不同需求而制备NK细胞产品提供思路。（2）通过对骨髓和脐带血单个核细胞进行体外培养激活,均可实现NK细胞高效活化扩增。BM-NK和UC-NK细胞的活化能力具有不同的优势,且细胞活力无明显差异。BM-NK和UC-NK细胞的对多种肿瘤细胞系呈现相近的杀伤毒性,可以为将来过继性免疫细胞治疗的广泛应用提供一定的选择参考。