结核病（TB）是由结核分枝杆菌（MTB）引起的慢性传染病，仍然是威胁人类健康的三大感染性疾病之一。目前全世界大约有20亿人被MTB感染，每年超过200万人死于结核病。尽管在全球范围内进行了大规模卡介苗接种以预防结核病，然而随着人口流动的增加、多重耐药结核菌株的出现、结核分枝杆菌合并HIV病毒感染以及卡介苗接种防护的自身局限性等原因，自20世纪以来，结核病的发生率在全球呈明显的上升趋势。 传统的结核病疫苗是卡介苗（BCG），虽然可有效预防儿童结核病尤其是结核性脑膜炎的发生，但对成人结核病的预防作用甚微，对免疫功能低下或免疫缺陷患者使用卡介苗则可引起严重的散播性结核病，其对人体的保护效力在0％～80％之间。鉴于卡介苗本身的局限性，研究和开发一种更有效、安全、适合各类人群使用的新型结核病疫苗势在必行。 实验室在前期的研究中成功构建了结核菌Ag85A与IL-21共表达核酸疫苗，实验证明共表达核酸疫苗免疫组小鼠的CTL活性明显增强、特异性淋巴细胞明显增殖、NK细胞杀伤活性与对照组相比有一定提高。在此基础上，我们用真核表达质粒pIRES作为载体，构建Ag85A-ESAT-6融合基因与IL-21共表达核酸疫苗，研究其诱导小鼠的免疫效应，为下一步该核酸疫苗抗结核杆菌感染的研究奠定基础。本实验分为两个部分： 一、结核杆菌Ag85A-ESAT-6融合基因及IL-21共表达核酸疫苗的构建及体外表达的鉴定 目的：利用真核表达质粒pIRES，构建结核杆菌Ag85A、ESAT-6融合基因与细胞因子IL-21共表达核酸疫苗pIRES-IL21-Ag85A-ESAT-6，并在骨髓瘤细胞（SP2/O）中表达。方法：先用PCR方法从本室保存的重组质粒pIRES-Ag85A中扩增出Ag85A基因序列并插入到质粒pIRES-ESAT-6上成为plRES-Ag85A-ESAT-6，再用PCR方法从pRSC-IL-21重组质粒中扩增出IL-21基因，构建于pIRES-Ag85A-ESAT-6重组质粒上，成为共表达核酸疫苗pIRES-IL21-Ag85A-ESAT-6。结果：经酶切、基因测序、RT-PCR证实重组核酸疫苗构建正确并能成功表达目的基因。结论：成功构建了结核杆菌Ag85A-ESAT-6融合基因及IL-21共表达核酸疫苗，为进一步研究其免疫效应奠定了基础。 二、结核杆菌Ag85A-ESAT-6融合基因及IL-21共表达核酸疫苗诱导C57BL/6小鼠免疫应答的初步研究 目的：研究结核杆菌Ag85A-ESAT-6融合基因及IL-21共表达核酸疫苗类似物对小鼠免疫功能的影响。方法：将100μg重组质粒免疫小鼠，共三次，每次间隔两周，总共300μg/只鼠。通过NK细胞活性、脾细胞细胞毒作用、脾细胞增殖试验、以及小鼠血清抗体、IFN-γ和IL-4水平的检测，评价结核杆菌Ag85A-ESAT-6融合基因及IL-21共表达核酸疫苗的免疫效果。结果：pLRES-IL-21-Ag85A-ESAT-6核酸疫苗免疫鼠的NK细胞活性、脾细胞细胞毒作用、脾细胞增殖反应及IFN-γ水平明显高于对照组，差异有显著性意义。该核酸疫苗还可引起小鼠血清抗体产生，与对照组相比具有统计学差异。结论：pIRES-IL-21-Ag85A-ESAT-6免疫组能够诱导小鼠产生有效的细胞免疫反应，为进一步在动物体内进行保护性效应试验研究提供了依据。