肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是各国都比较常见的一种恶性肿瘤。近几年,肝癌的发病率明显上升,人们的生活、健康受到了严重威胁。尽管引发肝癌的危险性因子都已得到很好的研究,但是对该癌症发生的病理机制并不很清楚。随着越来越多的人被肝癌夺走了珍贵的生命,人们迫切需要对肝癌的发生、发展和转移的机制有更多的了解以便开发出治疗肝癌的有效方法。MicroRNAs (miRNAs),是内源性单链的非编码RNAs,长约19-25核苷酸,它们通过直接结合3’非编码区(3’UTR)目标信使RNA(mRNA),使这些mRNA翻译抑制或直接降解,从而调控下游相关基因的表达。研究表明,miRNAs参与了多阶段发育过程,包括胚胎发生、发展、细胞增殖、细胞凋亡等。越来越多的研究证实,大量miRNAs在癌症组织细胞中异常表达,作为癌基因或抑癌基因,它们在各种癌症的发生和发展过程中起着重要的调控作用。因此,可以通过研究miRNA靶向调控它们靶基因的表达情况,为癌症疾病探索新的治疗策略。相关研究发现,大量miRNAs在HCC中存在异常表达的情况,例如：有研究证实,miR-144在HCC中表达明显下调,作为肿瘤抑制miRNA的miR141,它通过靶向结合Tiaml和zinc finger E-box binding homeobox 2(ZEB2)抑制其表达从而抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。miR-302b的表达水平在临床肝癌病人中有明显降低,在体内和体外的实验中均证实miR-302b都能通过靶向结合AKT2抑制肿瘤的侵袭。miR-184作为一个致瘤性的miRNA,能在肝癌中直接靶向INPPL1基因。因此,对表达异常的miRNAs进一步研究有利于了解HCC的发生和发展。促红细胞生成素肝细胞受体(Erythropoietin-producing hepatocellular(EPH) receptors)属于酪氨酸激酶受体家族(receptor tyrosine kinases,RTKs)的亚家族,多种生物学过程都有这类蛋白的参与,同时在疾病的发生和发展过程中起着非常重要的作用。许多研究表明：EphA2,作为一个Eph受体家族的成员,其在肿瘤的发生、发展、转移和血管再生等多方面起到非常关键的作用。越来越多的研究表明EphA2是多种癌症的潜在治疗靶点,包括胃癌、食道鳞状细胞癌、胶质瘤、头颈鳞状细胞癌、卵巢癌、肝小胆管癌、肺癌、乳腺癌、直肠癌和前列腺癌等。例如：1i等人的研究中表明,EphA2在胃癌细胞中异常表达,并且参与了MicroRNA 520d-3p对癌细胞增值、迁移和侵袭的调控。最近研究结果表明,在肝癌细胞中EphA2也存在表达异常,并影响肝细胞癌病人的预后和生存率。fan等人的研究显示,EphA2在肝癌细胞中过表达,并且参与肝癌细胞的上皮间质转化过程。Yang等人的研究发现,EphA2在肝癌中过表达,并与肝癌的发展、转移和预后存在相关,但EphA2在肝癌中过表达的分子机制并不清楚。最近有研究发现miRNAs可通过靶向结合EphA2并调节EphA2的表达,这些miRNAs包括miR-141、miR-520d-3p、miR-200a和miR-26b。以上研究表明通过调查miRNAs与EphA2的靶向关系,有利于了解肝癌的发生、发展机制并能够为新的肝癌治疗策略提供有用的信息。第一部分microRNA-26b和EphA2在肝癌细胞中的表达研究目的：本部分主要探讨miR-26b和EphA2在8种肝癌细胞系(HepG2、SMMC7721、bel-7402、PLC、LM3、Huh7、97L和97H)和正常肝细胞系L02中的表达情况。研究方法：1.8种肝癌细胞系(HepG2、SMMC7721、bel-7402、PLC、LM3、Huh7、97L和97H)和正常肝细胞系L02的培养在DMEM培养基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中培养。2. qRT-PCR分析miR-26b在8种肝癌细胞和正常肝细胞中的表达水平。3.Western blot分析EphA2在8种肝癌细胞和正常肝细胞中的表达水平。研究结果：1.与正常肝细胞相比,7种肝癌细胞(HepG2、SMMC7721、bel-7402、PLC.LM3.97L和97H)中miR-26b的表达明显下调。2.与正常肝细胞相比,6种肝癌细胞(HepG2、SMMC7721、be1-7402、LM3、97L和97H)中EphA2的表达明显上调。研究结论：miR-26b在肝癌中可能是一种肿瘤抑制miRNA,而EphA2可能为一种致瘤性基因,miR-26b可能会调控EphA2表达。第二部分microRNA-26b调控EphA2表达的报告基因验证研究目的：本部分主要研究肝癌中microRNA-26b与EphA2是否存在靶向调控关系。研究方法：1.使用生物信息软件www.microRNA.org和TargetScan预测microRNA-26b与EphA2的靶向结合位点。2.miR-26b mimics、miR-26b inhibitor和阴性对照(negative control)购买自RiboBio公司(Guangzhou,Guangdong,China)。构建EphA2突变体。3.采用双荧光素酶报告基因验证microRNA-26b与EphA2之间的靶向关系。研究结果：1.使用生物信息软件www.microRNA.org和TargetScan预测,microRNA-26b能够靶向结合EphA2。2.通过双荧光素酶报告基因分析,我们的研究发现共转染miR-26b mimics能够明显抑制正常EphA2的荧光活性,但是对突变EphA2的荧光活性无影响。研究结论：在肝癌细胞中,miR-26b可以直接靶向结合EphA2,证明EphA2可能是miR-26b的一个靶基因。关键词：双荧光素酶报告基因；靶基因；TargetScan第三部分miR-26b下调EphA2表达影响肝癌细胞增殖、迁移和侵袭研究研究目的：研究miR-26b和EphA2的表达对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。研究方法：miR-26b mimics、miR-26b inhibitor和阴性对照(negative control)购买自RiboBio公司(Guangzhou,Guangdong,China),并将其转染入肝癌细胞中,分别用来过表达miR-26b、miR-26b沉默和相应阴性对照。EphA2 mimics、miR-26b和EphA2对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响分别使用Cell Counting Kit(CCK-8)、transwell invasion方法和wound healing方法进行检测。细胞CCK8增殖能力检测,设置时间点分别为0、12、24、48、72、96h。使用western blot分析转录基因c-Myc、cyclin D1表达水平。研究结果：1.我们将miR-26b mimics、EphA2 mimics和阴性对照(negative control),转染入肝癌细胞后,24小时检测miR-26b和EphA2的表达。我们发现,miR-26b mimics转染能够明显提高肝癌细胞中miR-26b的表达水平,差异有统计学意义(p<0.05)；EphA2 mimics转染能够明显提高肝癌细胞中EphA2的表达水平,差异有统计学意义(p<0.05)；随后,我们将miR-26b mimics和EphA2 mimics共转染肝癌细胞,我们发现共转染miR-26b mimics和EphA2 mimics的肝癌细胞中miR-26b的表达水平明显高于阴性对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。2.CCK-8分析揭示了miR-26b和EphA2表达对肝癌细胞增值能力的影响。结果显示：过表达miR-26b的肝癌细胞的增殖活性从24 h开始低于对照组细胞,差异有统计学意义(p<0.01),在48 h和72 h,过表达miR-26b的肝癌细胞其增殖活性也明显低于对照组细胞,差异有统计学意义(p<0.01)。但是,共转染miR-26b mimics和EphA2 mimics细胞的增值能力与对照组细胞相比反而升高,并在48 h达到平台期,差异有统计学意义(p<0.01)。3.Transwell侵袭结果表明：与对照组相比,过表达miR-26b肝癌细胞的侵袭能力明显降低,差异有统计学意义(p<0.01)。但是,共转染miR-26b mimics和EphA2 mimics的细胞与对照组细胞相比其侵袭能力反而升高,差异有统计学意义(p<0.01)。4. Wound-healing结果表明：过表达miR-26b肝癌细胞的迁移能力明显低于对照组细胞,差异有统计学意义(p<0.01)。但是,共转染miR-26b mimics和EphA2 mimics的细胞与对照组细胞相比其迁移能力反而升高(p<0.01)。5. Western blot结果表明：miR-26b mimics能显著降低肝癌细胞内EphA2、c-Myc和cyclin D1等蛋白的表达水平,差异有统计学意义(p<0.01)；共转染miR-26b mimics和EphA2 mimics的细胞与对照组细胞相比,肝癌细胞内EphA2、c-Myc和cyclin D1的表达水平明显升高,差异有统计学意义(p<0.01)。研究结论：miR-26b能通过靶向抑制EphA2的表达来降低肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力,c-Myc-CyclinDl信号通路可能是实现这一调控作用的途径。