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骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种严重影响患者生活质量的关节退行性疾病，主要症状表现为由多种因素引起的关节软骨、软骨下骨、滑膜病变导致的关节疼痛、肿胀及僵直，累及部位包括膝、髋、踝、手等多个关节，长期、缠绵的病痛给患者家庭和社会造成了巨大的经济负担。黄荆子为马鞭草科牡荆属植物黄荆Vitex negundoL．的干燥成熟果实，具有祛风止痛、舒经活络的功效，在民间常用于治疗类风湿性关节炎（RA）等疾病。课题组前期阐明了黄荆子的抗RA活性物质基础为苯代萘型木脂素，经第一代制备工艺（G1）富集得到黄荆子总木脂素（totallignans ofVitex negundo,TOV），在实验室10kg级放大试验中获得了纯度为50%的TOV原料药，主要包括4个成分：6-hydroxy-4-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-3-hydroxymethyl-7-methoxy-3,4-dihydro-2-nap hthaldehyde（VNL）、vitedoinA、vitexdoin A和vitexdoamine A。但该制备方法尚未成熟，纯度、转移率均无法满足中试放大生产的需求，需进一步优化。鉴于RA与OA病理表现有诸多相似之处，本课题拟在优化TOV制备工艺的基础上，系统进行TOV的抗OA药效学评价并明确其药代动力学特征，主要研究内容如下：
1.TOV制备工艺优化及中试试验
在课题组前期建立的TOV制备工艺基础上，对工艺流程进行调整，删去原有的聚酰胺纯化环节，将萃取步骤提至大孔吸附树脂上样前，重新筛选了多种新型、高效大孔树脂填料，采用单因素考察法获取了萃取、大孔树脂纯化工艺的最佳条件，而后利用实验室所获的最佳条件进行了100kg级、210kg级各三批中试试验。结果显示，新工艺中萃取最佳条件为：pH=6.0，水相：乙酸乙酯相=1：4（体积比），萃取两次。LX-3020型大孔树脂吸附-解析性能优于其他型号树脂，最佳条件为:上样液TOV浓度1.5mg/mL，上样体积14BV，20%乙醇洗脱体积4BV，40%乙醇洗脱体积8BV，合并40%乙醇洗脱液后经50℃减压浓缩，45℃真空干燥，粉碎后过80目筛后既得TOV原料药粉末。该中试工艺所得TOV原料药纯度为64.4%-72.8%，TOV总转移率为58.0-66.6%，得率5.5-6.0‰。该制备工艺稳定可靠，简便易行，满足工业化大规模生产需求。
2.TOV抗骨关节炎活性研究
基于课题组前期对于类风湿性关节炎（RA）的研究，对新工艺下获得的TOV进行了抗OA活性研究，选用碘乙酸钠（MIA）诱导的SD大鼠OA模型，大鼠随机分为6组（n=8）：空白组、模型组、阳性药组（塞来昔布，17.1mg/kg）、TOV低、中、高剂量组（20、40、80mg/kg），灌胃给药TOV一周，麻醉后取血及右后肢。采用Electric Von Frey电子测痛仪测定大鼠右膝关节机械痛阈值，膝关节切片苏木精-伊红染色法（H&E），番红-固绿染色（S&F）法观察关节病理状态，ELISA试剂盒检测各组血清中TNF-α，IL-1β，IL-6，PGE2水平。结果显示，连续给药一周后，TOV组痛阈值比模型组显著提高，且呈现剂量依赖关系，试验终点痛阈值与空白组和阳性药组无显著差异。观察各组右膝关节H&E、S&F切片，与模型组相比,TOV组显著改善软骨结构病变（p＜0.01），软骨细胞减少（p＜0.001）及全关节评分（p＜0.001）。ELISA试剂盒检测结果显示TOV组血清中TNF-α，IL-1β，PGE2水平较模型组显著降低（p＜0.001），IL-6水平无显著差异。由此表明TOV对OA具有有较好的治疗作用，有望开发成为OA治疗药物。
3.TOV对急性血瘀SD大鼠血液流变的影响
SD大鼠随机分为7组，模型1组（n=15），阳性药2组（阿司匹林50mg/kg，脑心通0.5g/kg，n=11），空白组1组（n=10），TOV分为低、中、高剂量3组（10mg/kg，30mg/kg，90mg/kg，n=10），连续给药一周后除正常组外均造模，采用注射盐酸肾上腺素加冰水冷浴法造成SD大鼠急性血瘀模型，而后麻醉大鼠，腹主动脉取血，肝素钠抗凝及促凝管促凝各一份。观察指标为：1.各组别体重差异。2.大鼠全血粘度、血浆粘度、红细胞聚集率、ADP诱导的血小板聚集。3.细胞因子：血清中TXB2、6-Keto-PGF1α水平及TXB2/6-Keto-PGF1α比值。结果显示，正常对照组、模型组和各药物处理组大鼠进食饮水、毛色、活动无异常，组间体重差异无统计意义（p＞0.05）。TOV和脑心痛组，对于盐酸肾上腺素更加耐受，存活率与模型组相比显著提高（p＜0.05）；给予阿司匹林、脑心通和90mg/kgTOV组能显著抵抗血浆粘度升高（p＜0.01）；阿司匹林和脑心通显著下降TBX2水平（p＜0.01），给药组均能显著下调6-Keto-PGF1α水平（p＜0.001），TXB2与6-Keto-PGF1α比值方面，阳性药阿司匹林和脑心通下调趋势较显著（p＜0.001）；90mg/kg TOV组与模型组相比，有下调作用趋势。
4.TOV药代动力学研究
采用UPLC-MS法同时测定大鼠给药TOV后血浆中VNL，vitedoin A的浓度，30只SD大鼠随机分为4个灌胃组和一个静脉注射组，每组6只，给药后分别于预先设定的14个时间点取血，离心得血浆样本，纯化后进样，所得数据采用WinNonlin6.2药代动力学软件处理，以非房室模型法求算各药动学参数。结果显示，在UPLC-MS上建立的VNL，vitedoinA标准曲线良好，方法稳定，准确度高，可重复性强，符合生物样品分析要求。VNL，vitedoinA在TOV给药的4个剂量（25、50、100、200mg/kg）下的主要药动学参数（Cmax，AUC0-24，MRT0-inf_obs）呈浓度依赖关系；两者体内代谢过程类似，Tmax≈10min，t1/2分别为2.82h，1.33h吸收代谢较快；生物利用度分别为15.34%~21.89%，16.29%～22.11%。
1.TOV制备工艺优化及中试试验
在课题组前期建立的TOV制备工艺基础上，对工艺流程进行调整，删去原有的聚酰胺纯化环节，将萃取步骤提至大孔吸附树脂上样前，重新筛选了多种新型、高效大孔树脂填料，采用单因素考察法获取了萃取、大孔树脂纯化工艺的最佳条件，而后利用实验室所获的最佳条件进行了100kg级、210kg级各三批中试试验。结果显示，新工艺中萃取最佳条件为：pH=6.0，水相：乙酸乙酯相=1：4（体积比），萃取两次。LX-3020型大孔树脂吸附-解析性能优于其他型号树脂，最佳条件为:上样液TOV浓度1.5mg/mL，上样体积14BV，20%乙醇洗脱体积4BV，40%乙醇洗脱体积8BV，合并40%乙醇洗脱液后经50℃减压浓缩，45℃真空干燥，粉碎后过80目筛后既得TOV原料药粉末。该中试工艺所得TOV原料药纯度为64.4%-72.8%，TOV总转移率为58.0-66.6%，得率5.5-6.0‰。该制备工艺稳定可靠，简便易行，满足工业化大规模生产需求。
2.TOV抗骨关节炎活性研究
基于课题组前期对于类风湿性关节炎（RA）的研究，对新工艺下获得的TOV进行了抗OA活性研究，选用碘乙酸钠（MIA）诱导的SD大鼠OA模型，大鼠随机分为6组（n=8）：空白组、模型组、阳性药组（塞来昔布，17.1mg/kg）、TOV低、中、高剂量组（20、40、80mg/kg），灌胃给药TOV一周，麻醉后取血及右后肢。采用Electric Von Frey电子测痛仪测定大鼠右膝关节机械痛阈值，膝关节切片苏木精-伊红染色法（H&E），番红-固绿染色（S&F）法观察关节病理状态，ELISA试剂盒检测各组血清中TNF-α，IL-1β，IL-6，PGE2水平。结果显示，连续给药一周后，TOV组痛阈值比模型组显著提高，且呈现剂量依赖关系，试验终点痛阈值与空白组和阳性药组无显著差异。观察各组右膝关节H&E、S&F切片，与模型组相比,TOV组显著改善软骨结构病变（p＜0.01），软骨细胞减少（p＜0.001）及全关节评分（p＜0.001）。ELISA试剂盒检测结果显示TOV组血清中TNF-α，IL-1β，PGE2水平较模型组显著降低（p＜0.001），IL-6水平无显著差异。由此表明TOV对OA具有有较好的治疗作用，有望开发成为OA治疗药物。
3.TOV对急性血瘀SD大鼠血液流变的影响
SD大鼠随机分为7组，模型1组（n=15），阳性药2组（阿司匹林50mg/kg，脑心通0.5g/kg，n=11），空白组1组（n=10），TOV分为低、中、高剂量3组（10mg/kg，30mg/kg，90mg/kg，n=10），连续给药一周后除正常组外均造模，采用注射盐酸肾上腺素加冰水冷浴法造成SD大鼠急性血瘀模型，而后麻醉大鼠，腹主动脉取血，肝素钠抗凝及促凝管促凝各一份。观察指标为：1.各组别体重差异。2.大鼠全血粘度、血浆粘度、红细胞聚集率、ADP诱导的血小板聚集。3.细胞因子：血清中TXB2、6-Keto-PGF1α水平及TXB2/6-Keto-PGF1α比值。结果显示，正常对照组、模型组和各药物处理组大鼠进食饮水、毛色、活动无异常，组间体重差异无统计意义（p＞0.05）。TOV和脑心痛组，对于盐酸肾上腺素更加耐受，存活率与模型组相比显著提高（p＜0.05）；给予阿司匹林、脑心通和90mg/kgTOV组能显著抵抗血浆粘度升高（p＜0.01）；阿司匹林和脑心通显著下降TBX2水平（p＜0.01），给药组均能显著下调6-Keto-PGF1α水平（p＜0.001），TXB2与6-Keto-PGF1α比值方面，阳性药阿司匹林和脑心通下调趋势较显著（p＜0.001）；90mg/kg TOV组与模型组相比，有下调作用趋势。
4.TOV药代动力学研究
采用UPLC-MS法同时测定大鼠给药TOV后血浆中VNL，vitedoin A的浓度，30只SD大鼠随机分为4个灌胃组和一个静脉注射组，每组6只，给药后分别于预先设定的14个时间点取血，离心得血浆样本，纯化后进样，所得数据采用WinNonlin6.2药代动力学软件处理，以非房室模型法求算各药动学参数。结果显示，在UPLC-MS上建立的VNL，vitedoinA标准曲线良好，方法稳定，准确度高，可重复性强，符合生物样品分析要求。VNL，vitedoinA在TOV给药的4个剂量（25、50、100、200mg/kg）下的主要药动学参数（Cmax，AUC0-24，MRT0-inf_obs）呈浓度依赖关系；两者体内代谢过程类似，Tmax≈10min，t1/2分别为2.82h，1.33h吸收代谢较快；生物利用度分别为15.34%~21.89%，16.29%～22.11%。