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帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)是一种常见的慢性、进行性神经退行性疾病,其病理特征为黑质致密带(substantia nigra par compacta,SNpc)多巴胺(dopamine,DA)能神经元的变性缺失,以及路易小体(Lewy Body,LB)的形成。研究发现,PD发病中,星形胶质细胞和小胶质细胞激活,产生大量炎症因子,与DA能神经元上相应受体结合使其变性死亡。星形胶质细胞产生的炎症因子还会激活小胶质细胞使炎症状态扩大,加速PD的进程。因此有效抑制星形胶质细胞的炎症反应将对PD具有保护作用。另有研究表明,PD患者和动物模型的SN区铁含量增加,二价金属离子转运蛋白1(DMT1)表达增高。已证实异常的铁聚集会一定程度上加剧星形胶质细胞的激活,进而加速DA能神经元的变性死亡。近年来大量的研究证明,大麻素Ⅱ型受体(cannabinoid type 2 receptor,CB2受体)在PD的发病中起重要作用。激活胶质细胞上CB2受体可以通过抑制炎症因子的释放保护DA能神经元。激活CB2受体还可以介导DMT1的丝氨酸磷酸化,从而调节铁转运。本室前期研究发现CB2受体的激活可能通过抑制1-甲基-4-苯基吡啶阳离子(1-methy1-4-phenylpyridinium,MPP+)对DMT1的蛋白表达来抑制铁向细胞内的转运,从而减轻氧化应激对SH-SY5Y细胞的损伤。因此,我们推测激活CB2受体可能通过抑制DMT1的表达来减缓铁向星形胶质细胞的转运,从而发挥抗炎作用。本实验选取MPP+处理的原代培养大鼠星形胶质细胞作为观察对象,应用免疫印迹法检测观察不同时间点CB2受体表达的改变;选用特异性CB2受体激动剂JWH133和CB2受体拮抗剂AM630进行实验,激动剂与拮抗剂对细胞进行预处理,加入MPP+刺激,应用免疫印迹法以及实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测各组细胞相关炎症因子iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β的蛋白以及mRNA表达;应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞上清液中TNF-α和IL-1β的蛋白含量;应用免疫印迹法检测各组铁转运蛋白DMT1的磷酸化水平及总蛋白的表达;应用激光共聚焦显微镜扫描技术对各组细胞铁转入功能进行检测。实验结果如下:1.应用GFAP和Hoechst双染检测原代星形胶质细胞纯度。原代培养细胞GFAP阳性率在95%以上。2.应用免疫印迹法,我们检测了MPP+处理不同时间点(2、4、8和24h)星形胶质细胞CB2受体蛋白水平的变化。与对照组相比,MPP+组星形胶质细胞CB2受体的表达显著升高,且具有一定的时间依赖性。在4 h时CB2受体蛋白表达达到峰值(P<0.001),MPP+处理8h和24 h时其蛋白表达虽有恢复趋势,但仍高于对照组(P<0.05)。3.应用免疫印迹法,我们检测了4 h和24 h时不同处理组星形胶质细胞iNOS和COX-2蛋白水平的变化。与对照组相比,MPP+组处理后的iNOS和COX-2蛋白表达升高(P<0.05);与MPP+组相比,JWH133预处理组iNOS和COX-2蛋白表达降低(P<0.05),AM630与JWH133共处理可阻断JWH133的作用(P<0.05,与JWH133/MPP+组相比)。4.应用RT-PCR技术,我们检测了4 h和24 h时不同处理组星形胶质细胞iNOS、COX-2、TNF-α和IL1-βmRNA的表达。MPP+处理引起细胞内iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β mRNA表达升高(P<.0.05);JWH133预处理组与MPP+组相比,iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β mRNA表达降低(P<0.05),AM630与JWH133共处理可阻断JWH133的作用(P<0.05,与JWH133/MPP+组相比)。5.应用ELISA方法,我们检测了4 h和24 h时不同处理组星形胶质细胞上清液中TNF-α和IL-1β蛋白含量的变化。JWH133预处理可抑制由MPP+引起的星形胶质细胞TNF-α和IL-1β蛋白释放量增加,而AM630可以阻断JWH133的抑制作用(P<0.01,与JWH133/MPP+组相比)。6.应用免疫印迹法,我们检测了不同处理组星形胶质细胞DMT1蛋白以及其磷酸化蛋白表达的变化。JWH133预处理可以抑制MPP+处理引起的DMT1磷酸化蛋白的升高(P<0.05),AM630可阻断JWH133的作用(P<0.01,与JWH133/MPP+组相比)。与对照组相比,MPP+组的DMT1蛋白表达升高,JWH133预处理抑制这种升高(P<0.01),AM630可阻断JWH133的抑制作用(P<0.001,与JWH133/MPP+组相比)。7.应用激光共聚焦显微镜扫描技术对星形胶质细胞铁转入进行检测。使用MPP+处理体外培养的星形胶质细胞,在24 h时,使用硫酸亚铁溶液在灌流槽中对细胞进行灌流,使用钙黄绿素作为指示剂对细胞的荧光强度进行扫描观察,荧光越弱,细胞铁转入能力越强。与对照组相比,MPP+组的荧光猝灭较快,表明其铁转入能力增加;JWH133预处理组与MPP+组相比,细胞的荧光猝灭减缓,表明JWH133/MPP+组细胞铁转入有所减缓,使用AM630共同作用可阻断JWH133的作用,使细胞的荧光猝灭速度加快。以上结果表明,JWH133激活星形胶质细胞上的CB2受体,可以抑制由MPP+引起的炎症因子iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β的基因和蛋白表达,提示CB2受体的激活可抑制MPP+引起的星形胶质细胞神经炎症。JWH133激活星形胶质细胞上的CB2受体还可以抑制由MPP+引起的DMT1及其磷酸化蛋白的表达,减缓细胞铁转入,提示CB2受体的激活能通过抑制MPP+对星形胶质细胞上DMT1的功能来调节细胞摄铁,从而发挥抗炎作用。