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目的:探讨体外培养条件下胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对脑室下区(sVZ)神经干细胞(NSCs)表达Pitx3、酪氨酸羟化酶(TH)的影响及GDNF联合SVZ区NSCs脑内移植对帕金森病(PD)大鼠的治疗作用。
体外部分:
方法:
1、NSCs培养:取E14.5d SD大鼠及新生SD大鼠SVZ组织制备成单细胞悬液,接种到含有表皮生长因子(EGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、B27的DMEM/F12(1:1)的无血清培养液中培养,待形成原代克隆球后,用有限稀释法进行单细胞克隆和传代扩增,以获得大量来源相同的NSCs克隆球。
2、将培养传至第三代的NSCs与GDNF共培养。实验随机分为四组:胚鼠NSCs组(EA培养组)、胚鼠NSCs+GDNF组(EB培养组)、新生鼠NSCs组(NA培养组)和新生鼠NSCs+GDNF组(NB培养组)。用Ncstin、Pitx3、TH免疫组织化学法和Brdu、TH、Pitx3、Pitx3/TH免疫荧光法分别鉴定NSCs及其增殖与分化。
结果:
1、各组SVZ NSCs培养一周后都可以形成悬浮生长的NSCs球,经免疫组织化学检测显示80%以上的细胞呈Nestin阳性,免疫荧光检测显示90%以上呈Brdu阳性。
2、EA培养组NSCs培养7d时,形成典型的神经球悬浮生长,10d后细胞活性下降,球体积不再增大,球中心透亮度明显下降;NA培养组NSCs神经球形成较EA培养组晚,在培养7.5d形成典型的NSCs神经球,12d后偶见神经球贴壁分化;EB培养组和NB培养组分别在5d和7d时形成神经球,两组神经球10d时球体积不断增大,12d后球体积不再增大,开始贴壁并向四周伸出突起。对四组神经球进行计数,分别为:EB培养组12.40±3.03,EA培养组9.20±2.97,两组比较P<0.05。NB培养组10.00±2.28,NA培养组6.50±1.64,两组比较P<0.05。EB培养组多于NB培养组(P<0.05),EA培养组多于NA培养组(P<0.05)。
3、14d时进行TH、Pitx3、Pitx3/TH免疫荧光和免疫组织化学鉴定,上述四个组的TH、Pitx3、Pitx3/TH阳性细胞数分别为:EA培养组2.83±0.75、3.83±1.17、2.33±1.03;EB培养组11.83±1.72,16.33±1.86,9.50±1.17;NA培养组2.83±1.47,3.174±1.33,1.83±1.17;NB培养组9.16±1.47、12.83±1.60、6.83±1.47。EB培养组与EA培养组,NB培养组与NA培养组及.EB培养组与NB培养组比较均有显著性差异P<0.05。
在体移植部分:
方法:
1、立体定位下,于左侧黑质致密部(SNe)和腹侧被盖区(VTA)注射6-OHDA制备PD大鼠模型。将成功PD大鼠模型随机分成6组:即模型对照组;假手术对照组(注入生理盐水):胚鼠NSCs移植组(EA移植组);胚鼠NSCs+GDNF移植组(EB移植组);新生鼠NSCs移植组(NA移植组);新生鼠NSCs+GDNF移植组(NB移植组)。
2、将上述培养传代至第3代的胚鼠NSCs、GDNF+胚鼠NSCs和新生鼠NSCs、GDNF+新生鼠NSCs分别移植到PD模型大鼠吻侧纹状体内,移植细胞浓度为1.0×10<5>个细胞/μl。
3、于移植后7 d、14 d、30 d、60 d检测PD大鼠旋转行为变化后,取脑做冰冻切片,行HE染色和TH、Pitx3、Pitx3/TH免疫组化和免疫荧光染色。
结果:
1、旋转行为检测显示:模型对照组和假手术对照组在移植前后均无明显改变;细胞移植后7~14d,4组大鼠的旋转行为均无明显变化;第30d时,各移植组大鼠的旋转行为均有不同程度的改善,分别为:EB移植组7.50±1.29(r/min,以下同),EA移植组12.75±0.96,两组比较P<0.05;NB移植组9.75±0.96,NA移植组12.50±1.29,两组比较P<0.05;EB移植组较NB移植组大鼠旋转行为改善明显P<0.05;各移植组在30d与60d时大鼠旋转行为检测比较未见明显差异(P>0.05);
2、移植后一周HE染色显示,移植细胞呈簇状或串状沿针道分布,细胞数量较多。
3、TH、Pitx3和nt/Pitx3免疫组织化学和免疫荧光检测显示:生理盐水组和模型对照组于各时间点均未见有TH和Pitx3阳性细胞。各细胞移植组移植后第7d,移植区均见有少量TH、Pitx3和TH/Pitx3阳性细胞,TH、Pitx3和TH/Pitx3阳性细胞数分别为:EA移植组51.75±2.21、62.75±3.10、38.00±4.08;EB移植组61.50±2.65、81.50±4.66、46.50±4.20;NA移植组42.00±3.37、56.75±4.03、27.50±4.12;NB移植组51.25±2.63、68.50±3.70、38.25±2.50。阳性细胞呈圆形或椭圆形,无突起,集中分布在针道周围。第14d时,各移植组移植区TH、Pitx3和TH/Pitx3阳性细胞数量均有少量增加,EA移植组117.25±3.86、131.25±5.74、96.75±5.74;EB移植组142.25±4.99、162.254±5.06、133.50±4.43;NA移植组104.25±5.72、129.00±5.35、84.75±4.65:NB移植组116.50±4.51、149.75±2.99、97.75±3.95。阳性细胞形态基本同移植后第7d,分布在针道与纹状体实质的交界处。30d时各移植组移植区的TH、Pitx3和TH/Pitx3阳性细胞进一步增多,达到高峰,EA移植组216。25±5.67、235.25±4.99、207.50±4.80;EB移植组232.50±7.33、253.00±4.69、229.50±3.11;NA移植组208.25±6.55、228.25±3.86、198.50±6.61:NB移植组221.75±3.86、239.25±6.34、213.75±6.02。阳性细胞呈圆形或椭圆形,可见少许突起,阳性细胞沿针道呈放射状向纹状体实质扩散。60d时各移植组移植区的TH、Pitx3和TH/Pitx3阳性细胞未见有明显增多趋势,分别为EA移植组209.25±5.06、229.25±6.13、201.75±6.95;EB移植组238.75±6。85、260。50±5.07、231.75±5.68;NA移植组203.75±4.57、220.50±5.51、190.75±7.41;NB移植组225.25±4.92、243.50±5.57、216.25±6.55。阳性细胞形态与移植后30d时未见明显差异,但可见更多阳性细胞沿针道向外迁移。EB移植组和NB移植组在移植后30d时,TH、Pitx3和TH/PitX3阳性细胞数与EA移植组和NA移植组移植后7d、14d、30d比较均有显著性差别P<0.05;NB移植组与EB移植组移植后各时间点(除60d外)TH、Pitx3和TH/Pitx3阳性细胞数比较均有明显差异P<0.05;各组移植后30d和移植后60d比较,TH、Pitx3和TH/pitx3阳性细胞数未见明显差异P>0.05。
结论:
1、从E14.5胚鼠和新生大鼠SVZ分离得到的细胞具有不断增殖和自我更新的能力,是中枢神经系统NSCs;胚鼠NSCs比新生鼠NSCs的增殖与更新能力更强。
2、GDNF可以明显促进胚鼠和新生鼠SVZ的NSCs表达TH、Pitx3。
3、单纯胚鼠或新生鼠NSCs移植及与GDNF联合移植均能改善PD大鼠的旋转行为,但胚鼠NSCs与GDNF联合移植效果更佳。