目的:探讨体外培养条件下胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对脑室下区(sVZ)神经干细胞(NSCs)表达Pitx3、酪氨酸羟化酶(TH)的影响及GDNF联合SVZ区NSCs脑内移植对帕金森病(PD)大鼠的治疗作用。 体外部分： 方法: 1、NSCs培养：取E14.5d SD大鼠及新生SD大鼠SVZ组织制备成单细胞悬液，接种到含有表皮生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、B27的DMEM/F12(1:1)的无血清培养液中培养，待形成原代克隆球后，用有限稀释法进行单细胞克隆和传代扩增，以获得大量来源相同的NSCs克隆球。 2、将培养传至第三代的NSCs与GDNF共培养。实验随机分为四组：胚鼠NSCs组(EA培养组)、胚鼠NSCs+GDNF组(EB培养组)、新生鼠NSCs组(NA培养组)和新生鼠NSCs+GDNF组(NB培养组)。用Ncstin、Pitx3、TH免疫组织化学法和Brdu、TH、Pitx3、Pitx3/TH免疫荧光法分别鉴定NSCs及其增殖与分化。 结果: 1、各组SVZ NSCs培养一周后都可以形成悬浮生长的NSCs球，经免疫组织化学检测显示80％以上的细胞呈Nestin阳性，免疫荧光检测显示90％以上呈Brdu阳性。 2、EA培养组NSCs培养7d时，形成典型的神经球悬浮生长，10d后细胞活性下降，球体积不再增大，球中心透亮度明显下降；NA培养组NSCs神经球形成较EA培养组晚，在培养7.5d形成典型的NSCs神经球，12d后偶见神经球贴壁分化；EB培养组和NB培养组分别在5d和7d时形成神经球，两组神经球10d时球体积不断增大，12d后球体积不再增大，开始贴壁并向四周伸出突起。对四组神经球进行计数，分别为：EB培养组12.40±3.03，EA培养组9.20±2.97，两组比较P<0.05。NB培养组10.00±2.28，NA培养组6.50±1.64，两组比较P<0.05。EB培养组多于NB培养组(P<0.05)，EA培养组多于NA培养组(P<0.05)。 3、14d时进行TH、Pitx3、Pitx3/TH免疫荧光和免疫组织化学鉴定，上述四个组的TH、Pitx3、Pitx3/TH阳性细胞数分别为：EA培养组2.83±0.75、3.83±1.17、2.33±1.03；EB培养组11.83±1.72，16.33±1.86，9.50±1.17；NA培养组2.83±1.47，3.174±1.33，1.83±1.17；NB培养组9.16±1.47、12.83±1.60、6.83±1.47。EB培养组与EA培养组，NB培养组与NA培养组及.EB培养组与NB培养组比较均有显著性差异P<0.05。 在体移植部分： 方法: 1、立体定位下，于左侧黑质致密部(SNe)和腹侧被盖区(VTA)注射6-OHDA制备PD大鼠模型。将成功PD大鼠模型随机分成6组：即模型对照组；假手术对照组(注入生理盐水)：胚鼠NSCs移植组(EA移植组)；胚鼠NSCs+GDNF移植组(EB移植组)；新生鼠NSCs移植组(NA移植组)；新生鼠NSCs+GDNF移植组(NB移植组)。 2、将上述培养传代至第3代的胚鼠NSCs、GDNF+胚鼠NSCs和新生鼠NSCs、GDNF+新生鼠NSCs分别移植到PD模型大鼠吻侧纹状体内，移植细胞浓度为1.0×10<5>个细胞/μl。 3、于移植后7 d、14 d、30 d、60 d检测PD大鼠旋转行为变化后，取脑做冰冻切片，行HE染色和TH、Pitx3、Pitx3/TH免疫组化和免疫荧光染色。 结果: 1、旋转行为检测显示：模型对照组和假手术对照组在移植前后均无明显改变；细胞移植后7～14d，4组大鼠的旋转行为均无明显变化；第30d时，各移植组大鼠的旋转行为均有不同程度的改善，分别为：EB移植组7.50±1.29(r/min，以下同)，EA移植组12.75±0.96，两组比较P<0.05；NB移植组9.75±0.96，NA移植组12.50±1.29，两组比较P<0.05；EB移植组较NB移植组大鼠旋转行为改善明显P<0.05；各移植组在30d与60d时大鼠旋转行为检测比较未见明显差异(P>0.05)； 2、移植后一周HE染色显示，移植细胞呈簇状或串状沿针道分布，细胞数量较多。 3、TH、Pitx3和nt/Pitx3免疫组织化学和免疫荧光检测显示：生理盐水组和模型对照组于各时间点均未见有TH和Pitx3阳性细胞。各细胞移植组移植后第7d，移植区均见有少量TH、Pitx3和TH/Pitx3阳性细胞，TH、Pitx3和TH/Pitx3阳性细胞数分别为：EA移植组51.75±2.21、62.75±3.10、38.00±4.08；EB移植组61.50±2.65、81.50±4.66、46.50±4.20；NA移植组42.00±3.37、56.75±4.03、27.50±4.12；NB移植组51.25±2.63、68.50±3.70、38.25±2.50。阳性细胞呈圆形或椭圆形，无突起，集中分布在针道周围。第14d时，各移植组移植区TH、Pitx3和TH/Pitx3阳性细胞数量均有少量增加，EA移植组117.25±3.86、131.25±5.74、96.75±5.74；EB移植组142.25±4.99、162.254±5.06、133.50±4.43；NA移植组104.25±5.72、129.00±5.35、84.75±4.65：NB移植组116.50±4.51、149.75±2.99、97.75±3.95。阳性细胞形态基本同移植后第7d，分布在针道与纹状体实质的交界处。30d时各移植组移植区的TH、Pitx3和TH/Pitx3阳性细胞进一步增多，达到高峰，EA移植组216。25±5.67、235.25±4.99、207.50±4.80；EB移植组232.50±7.33、253.00±4.69、229.50±3.11；NA移植组208.25±6.55、228.25±3.86、198.50±6.61：NB移植组221.75±3.86、239.25±6.34、213.75±6.02。阳性细胞呈圆形或椭圆形，可见少许突起，阳性细胞沿针道呈放射状向纹状体实质扩散。60d时各移植组移植区的TH、Pitx3和TH/Pitx3阳性细胞未见有明显增多趋势，分别为EA移植组209.25±5.06、229.25±6.13、201.75±6.95；EB移植组238.75±6。85、260。50±5.07、231.75±5.68；NA移植组203.75±4.57、220.50±5.51、190.75±7.41；NB移植组225.25±4.92、243.50±5.57、216.25±6.55。阳性细胞形态与移植后30d时未见明显差异，但可见更多阳性细胞沿针道向外迁移。EB移植组和NB移植组在移植后30d时，TH、Pitx3和TH/PitX3阳性细胞数与EA移植组和NA移植组移植后7d、14d、30d比较均有显著性差别P<0.05；NB移植组与EB移植组移植后各时间点(除60d外)TH、Pitx3和TH/Pitx3阳性细胞数比较均有明显差异P<0.05；各组移植后30d和移植后60d比较，TH、Pitx3和TH/pitx3阳性细胞数未见明显差异P>0.05。 结论: 1、从E14.5胚鼠和新生大鼠SVZ分离得到的细胞具有不断增殖和自我更新的能力，是中枢神经系统NSCs;胚鼠NSCs比新生鼠NSCs的增殖与更新能力更强。 2、GDNF可以明显促进胚鼠和新生鼠SVZ的NSCs表达TH、Pitx3。 3、单纯胚鼠或新生鼠NSCs移植及与GDNF联合移植均能改善PD大鼠的旋转行为，但胚鼠NSCs与GDNF联合移植效果更佳。