论文部分内容阅读
目的:研究薯蓣皂苷(dioscin)抗胃/肠缺血再灌注损伤的生物学活性及分子机制。方法:(1)薯蓣皂苷抗胃缺血再灌注损伤实验中,体外采用人胃粘膜上皮细胞GES-1缺氧复氧模型,MTT法检测薯蓣皂苷对细胞损伤的保护作用;体内实验中,48只SD大鼠,随机分空白组、模型组、薯蓣皂苷高中低剂量给药组、阳性对照组(缺血预处理IPC),每组8只,给药组灌胃给予薯蓣皂苷60、30和15 mg/kg,每日一次,连续给药7天。第7天给药两小时后手术夹闭腹腔动脉30 min,再灌注60 min建立胃缺血再灌注损伤模型。处死动物后,检测胃粘膜损伤指数(GMII)、胃组织MDA含量、GSH-PX活力及组织病理学分析等指标评价薯蓣皂苷对胃缺血再灌注损伤的保护作用。分子机制研究中,采用免疫荧光、Real-time PCR和Western blotting等方法检测PKCα、p-PKCα、PKCβ2、p-PKCβ2、PKCε、p-PKCε、Raf-1、MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2、AP-1、PPAR-γ、NF-ΚB(P65)、IL-1β、IL-6、TNF-α和ICAM-1蛋白或基因表达的影响,用PKCα和PKCβ2抑制或过表达实验考察薯蓣皂苷对PKCα和PKCβ2及下游信号通路的影响。(2)在抗肠缺血再灌注损伤实验中,体外采用Caco2和IEC-6细胞缺氧复氧模型,给予不同浓度薯蓣皂苷(Caco2细胞给药浓度12.5、50和200 ng/m L;IEC-6细胞给药浓度6.25、25和100 ng/m L),作用6、12和24 h,建立细胞缺氧复氧模型,考察药物对细胞活力和细胞形态的影响,ROS探针检测氧化应激水平,Real-time PCR检测炎症因子,TUNEL法检测细胞凋亡。体内实验中,SD大鼠和C57BL/6小鼠各48只,随机分空白组、模型组、薯蓣皂苷高中低剂量给药组(SD大鼠给药剂量60、30和15mg/kg;C57BL/6小鼠给药剂量80、40和20 mg/kg)、阳性对照组(缺血预处理+缺血后处理IPC+IPO)。给药组动物连续7天口服给予相应剂量薯蓣皂苷,第7天给药两小时后,用动脉夹夹闭肠系膜上动脉45 min,再灌注90 min建立缺血再灌注损伤模型。处死动物后测定MDA、T-SOD、MPO氧化应激指标,Real-time PCR检测炎症因子,TUNEL法检测小肠组织细胞凋亡,结合小肠组织病理切片H&E分析和chiu’s score来评价薯蓣皂苷对肠缺血再灌注损伤的保护作用。分子机制研究中,采用mi RNA微阵列芯片(Microarrays)技术筛选药物作用后引起表达差异mi RNA,结合文献和Real-time PCR验证确定目的mi RNA,采用生物信息学和双荧光素酶报告基因实验确定其下游靶基因,采用免疫荧光、Western blotting、Real-time PCR和Antagomir转染等技术研究薯蓣皂苷抗肠缺血再灌注损伤的分子机制。结果:(1)在抗胃缺血再灌注损伤实验中,与模型组相比,薯蓣皂苷显著提高GES-1细胞活力,显著降低大鼠胃粘膜损伤指数和MDA含量,升高GSH-PX活力;分子机制研究表明薯蓣皂苷显著降低p-PKCα、p-PKCβ2、Raf-1和MEK1/2蛋白表达,减少ERK1/2的磷酸化及核移位,下调NF-κB和AP-1的转录活性从而使下游炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和ICAM-1的表达降低;PKCα、PKCβ2抑制和过表达实验证实薯蓣皂苷是通过下调p-PKCα和p-PKCβ2抑制PKC/ERK1/2信号通路减少氧化应激和炎症来发挥作用的。(2)在抗肠缺血再灌注损伤实验中,与模型组相比,薯蓣皂苷显著增加Caco2和IEC-6细胞活力,减少ROS产生和炎症因子释放,抑制细胞凋亡;体内研究发现薯蓣皂苷显著降低大小鼠小肠组织中MDA和MPO含量,显著升高SOD水平,降低chiu氏评分,减少炎症因子释放,抑制细胞凋亡。mi RNA微阵列芯片筛选出mi R-351-5p为目的mi RNA,其靶基因为Sirt6和MAPK13,薯蓣皂苷显著下调mi R-351-5p水平,上调Sirt6和MAPK13蛋白表达,减少PKD1蛋白磷酸化和NF-κB(p65)蛋白表达从而使下游炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和ICAM-1产生减少,活化AMPK减少Fox O3α蛋白磷酸化,增加Mn SOD和CAT蛋白表达抑制ROS产生,减少Bax、Cytc、Apaf-1、Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase9蛋白表达抑制细胞凋亡;通过mi R-351-5p干扰实验证实薯蓣皂苷是通过下调mi R-351-5p增加其靶基因MAPK13和Sirt6蛋白表达,抑制肠缺血再灌注过程中的氧化应激、炎症和凋亡发挥抗肠缺血再灌注损伤的保护作用。结论:薯蓣皂苷对胃缺血再灌注损伤具有较好的保护作用,这种作用是通过下调p-PKCα和p-PKCβ2抑制PKC/ERK1/2信号通路实现的;薯蓣皂苷对肠缺血再灌注损伤具有较好的保护作用,这种作用是通过下调mi R-351-5p水平,升高其下游靶基因MAPK13和Sirt6表达发挥抗炎、抗氧化和抗凋亡作用实现的。总之,薯蓣皂苷在抗胃/肠缺血再灌注损伤方面具有一定的研究和开发价值,也发现了mi R-351-5p/Sirt6和mi R-351-5p/MAPK13抗肠缺血再灌注损伤新的分子调控机制和药物作用靶点。