热稳定性κ-卡拉胶酶有利于酶的实践应用。本论文基于蛋白质折叠自由能的理性设计筛选和鉴定假交替单胞菌κ-卡拉胶酶热稳定性提高突变体,对突变酶进行酶学性质表征和酶解产物分析,并运用分子动力学模拟和结构分析研究突变酶的结构特征。通过本研究,筛选得到κ-卡拉胶酶热稳定性和催化活性协同进化酶,明确影响假交替单胞菌κ-卡拉胶酶热稳定性的关键残基;阐明κ-卡拉胶酶突变体的酶学性质和酶解产物的结构特征;明析关键残基变化对κ-卡拉胶酶结构及分子内部作用力的影响。本研究对改善κ-卡拉胶酶的热稳定性,扩大κ-卡拉胶酶的应用范围,以及酶结构与热稳定性和催化活性的构效关系研究具有重要意义。首先,通过Po PMu Si C在线分析工具计算每个氨基酸残基的折叠自由能（ΔΔG）变化,使用定点突变构建κ-卡拉胶酶突变体的基因工程菌株,突变酶在E.coli进行体外表达后,利用亲和层析纯化目的蛋白,并分析突变体的酶活性和热稳定性。结果表明,通过筛选和鉴定,获得κ-卡拉胶酶热稳定性和催化活性协同进化酶Q42V和I51H。与野生型κ-卡拉胶酶（WT）相比,Q42V和I51H的比活力分别提高了20%和25%;热处理40min后,酶活性丧失50%的T5040分别为51.8℃和48.7℃,比WT分别提高了9.0℃和5.9℃,上述两个突变体表现出比野生型κ-卡拉胶酶更高的酶活性和热稳定性。基于折叠自由能模拟筛选,获得κ-卡拉胶酶热稳定性和催化活性协同改良突变酶是可行的策略。其次,利用κ-卡拉胶作为底物,研究κ-卡拉胶酶突变体Q42V和I51H的酶学性质,包括温度、p H、金属离子、添加试剂对酶活性和稳定性的影响,以及动力学参数测定,最后利用质谱分析酶解产物。结果显示,Q42V和I51H的最适反应温度均为50℃,最适反应p H均为8.0,与WT一致。Q42V和I51H在50℃时的半衰期(t1/2)分别为18.4 min和14.6 min,分别比WT增加10.7 min和6.9 min。此外,差示扫描量热法测量熔点温度（Tm）的结果显示,Q42V和I51H的Tm值分别为58.2℃和54.8℃,高于WT的Tm值（51.2℃）,进一步说明突变体的热稳定性高于野生型。酶的动力学参数分析显示,相较于WT,Q42V和I51H的Vmax和kcat增大。LC-MS分析显示,Q42V和I51H酶解κ-卡拉胶的产物均为κ-卡拉胶二糖、四糖和六糖。κ-卡拉胶酶热稳定性提高突变体的酶学性质及酶解产物研究为突变酶的应用奠定理论基础。最后,运用圆二色谱、荧光光谱、表面疏水性分析、残基相互作用网络分析、分子对接和分子动力学模拟,对Q42V和I51H的二级结构、三级结构、表面疏水性、分子内部作用力、酶与底物的相互作用和酶分子动力学进行分析。研究发现,突变对Q42V和I51H的二级结构和三级结构没有明显影响,Q42V和I51H的表面疏水性高于WT。残基相互作用网络分析发现,与WT相比,Q42V和κ-卡拉胶四糖的相互作用增加了pi-sigma作用力,I51H和κ-卡拉胶四糖的相互作用增加了疏水相互作用,这可能是催化活性提高的原因。分子动力学模拟分析发现,随着模拟温度的升高,Q42V和I51H的均方根偏差和回旋半径低于WT,说明突变体的结构更加稳定和紧密。κ-卡拉胶酶突变体的分子动力学模拟和结构分析促进了酶结构与热稳定性和催化活性的构效关系研究。