益生芽孢杆菌以孢子的形式被摄入,但益生芽孢杆菌的菌株选择及其在体内萌发增殖是可能影响到芽孢发挥益生作用的关键,目前尚未有针对芽孢的萌发特性与其对应的体内益生效应做系统性研究。本论文以6种来源于商品的药用益生芽孢杆菌产品为基础,对其中所含有的6株芽孢杆菌进行了系统性研究。在对比分析其体外可能的益生特性、安全性的基础上,重点探讨了不同芽孢杆菌的萌发特性、相应的分子机制及其体内肠道保护效应,以期为芽孢杆菌的活性评价以及萌发选育提供研究基础。具体研究内容及结果如下:从购买的6种药用的益生芽孢杆菌产品中分离得到6株芽孢杆菌,对芽孢杆菌的产酶能力、抗菌和抗氧化活性、表面疏水性及营养体细胞耐酸稳定性等体外益生特性对其进行比较研究。结果表明,6株芽孢杆菌均具有一定的产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶的能力,均具有一定的表面疏水性,菌株营养体细胞均具有耐酸性;仅2株地衣芽孢杆菌L-1和L-2的发酵上清液具有一定的抗菌活性。但整体上从6株菌的体外益生活性评价上看,差异性不大。进一步对这6株菌的安全性进行了系统研究,分别从药敏试验、耐药性质粒检测、耐药基因检测和毒力基因检测等4个方面对6株芽孢杆菌进行了体外安全性评估。结果发现,6株益生芽孢杆菌均明显无耐药性风险,但每种芽孢杆菌均携带一种或多种肠毒素基因,因此益生芽孢杆菌的使用安全在菌种选育时还是需要重点关注。本论文重点探讨了益生芽孢杆菌的益生活性是否与菌株的萌发特性及在体内的萌发潜力相关。首先评价了6株芽孢杆菌的芽孢孢子对常见的营养性萌发剂的响应能力,发现6株芽孢杆菌的芽孢对不同营养型萌发剂的萌发响应具有一定的菌株特异性,但L-丙氨酸(L-Ala)均能在一定程度上促进这6株菌的芽孢萌发,其中对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S-2萌发影响最大,而且L-Ala的介导在体外显著性促进了B.subtilis S-2在限制性培养基条件下的生长。以实验室保存的一株对L-Ala几乎无萌发响应的菌株Bacillus subtilis 312作为对照菌株,从转录组水平分析了两个菌株对L-Ala萌发响应差异表达基因,发现B.subtilis S-2有8个基因表达显著上调,包括有ger D、ger KC、ger KB、ger AA、ger AB、ger AC、lgt和Spo0A。为了探讨L-Ala是否介导了芽孢杆菌在体内的萌发来促进芽孢对肠道健康的保护作用,在本实验室建立的Escherichia coli K99-m Cherry攻毒SD(Sprague-Dawley)大鼠模型的基础上,研究了L-Ala对B.subtilis S-2在体内促进芽孢萌发后对肠道病原菌的清除效应。试验分4个处理组,包括阳性试验组(攻毒组)和阴性对照组(不攻毒组),B.subtilis S-2芽孢试验组以及L-Ala诱导的B.subtilis S-2芽孢萌发试验组,每个处理6个重复,进行为期12天的大鼠饲养攻毒试验。大鼠适应2天后,通过饮水添加方式使大鼠每天摄入约10~7CFU B.subtilis S-2芽孢,在第7天分别给试验组大鼠一次性灌服1 m L 10~9CFU/m L肠毒性的E.coli K99-m Cherry,在攻毒后12 h,每个试验组随机取6只大鼠断颈处死,完整取肠道;剩下的大鼠收集攻毒后12 h、24 h、48 h和72 h粪便样品。测定试验期12 d的大鼠生长性能、粪便中E.coli K99-m Cherry的排出数量、肠道各段的E.coli K99-m Cherry数量。结果表明,L-Ala介导的B.subtilis S-2芽孢灌服大鼠后其日增重和采食量显著高于阳性试验组(即攻毒组),与阴性对照组(不攻毒组)无显著差异;对攻毒后大鼠粪便中的E.coli K99-m Cherry荧光菌株进行跟踪,发现在24 h后,L-Ala介导B.subtilis S-2芽孢组中E.coli K99-m Cherry菌落数显著的低于阳性对照组和单独的B.subtilis S-2芽孢组;L-Ala介导B.subtilis S-2芽孢组在各肠段的细菌浓度均最低,结果表明L-Ala介导的B.subtilis S-2芽孢组能够帮助大鼠免于病原菌的侵染;而单纯的B.subtilis S-2芽孢组对大鼠的健康保护作用明显较弱,因此,L-Ala介导B.subtilis S-2的芽孢增强了其芽孢对大鼠肠道健康的保护作用。综上所述,本实验在对6种商用益生芽孢杆菌菌株的益生特性、安全性进行了系统性评估的基础上,探讨了芽孢的体外体内的萌发特性,发现营养性萌发剂L-Ala能够显著促进芽孢的体内益生活性,为益生芽孢杆菌制剂的萌发选育提供了研究基础。