【摘 要】
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肝癌在我国发病率第五位,死亡率第三位,是肝脏中最常见的原发性癌症,其中肝细胞发生的恶性肿瘤（Hepatocellular carcinoma,HCC）占90%,严重危害我国人民生命健康。肝癌的筛查、早期诊断以及治疗手段有待改进。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（Glypican-3,GPC3）是固定在细胞表面的一种膜蛋白,与肝癌的发生、发展及预后密切相关,存在于HCC患者血清中,并且在HCC组织上特异性表达
【基金项目】
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广州市科技计划项目（201903010034）；
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肝癌在我国发病率第五位,死亡率第三位,是肝脏中最常见的原发性癌症,其中肝细胞发生的恶性肿瘤（Hepatocellular carcinoma,HCC）占90%,严重危害我国人民生命健康。肝癌的筛查、早期诊断以及治疗手段有待改进。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（Glypican-3,GPC3）是固定在细胞表面的一种膜蛋白,与肝癌的发生、发展及预后密切相关,存在于HCC患者血清中,并且在HCC组织上特异性表达。GPC3不仅是诊断HCC的生物特异性标志物,也是治疗HCC的重要的潜在生物标记物。制备针对GPC3的高亲和力、高特异性抗体,对研究GPC3在肝癌发生过程中的作用机制,建立更高效的检测方法提高HCC的早期诊断率和准确性,改善目前已有治疗手段的不足具有十分重要的意义。本论文主要分为以下四部分:第一部分GPC3-N蛋白的原核表达与鉴定以人GPC3基因为模板,进行PCR扩增得到GPC3-N基因,经过Eco R I和Xho I双酶切,插入到p ET-22b原核表达载体上,经鉴定后的p ET-22b-GPC3-N通过热激转化到大肠杆菌BL21（DE3）p Lys S感受态细胞中,加入IPTG诱导表达重组蛋白并且优化其表达条件（温度、时间、诱导剂浓度）,借助SDS-PAGE电泳以及蛋白免疫印迹技术进行鉴定。成功构建了pET-22b-GPC3-N表达载体;在大肠杆菌BL21（DE3）p Lys S中表达GPC3-N蛋白;确定最佳诱导条件为37℃,终浓度为0.1 m M IPTG,诱导10 h;纯化后的蛋白具有免疫原性,浓度达到1 mg/m L,纯度达到90%。第二部分抗GPC3-N蛋白的兔多克隆抗体的制备利用前期制备的GPC3-N蛋白免疫雌性新西兰大白兔,经辛酸-硫酸铵法纯化获得抗GPC3-N的兔多克隆抗体。通过ELISA、Western blot、免疫荧光技术检测获得的抗GPC3-N的兔多克隆抗体与真核表达的GPC3蛋白和肝癌细胞HepG2表达的GPC3的结合力。免疫兔血清有较高效价,其滴度可达到1:256,000以上;辛酸-硫酸铵法纯化免疫兔血清可以得到纯度高的兔多克隆抗体;抗体具有很好的免疫活性和免疫反应性;抗体不仅能识别商品化全长GPC3也能特异性识别肝癌细胞HepG2上表达的GPC3蛋白。第三部分噬菌体展示纳米抗体文库的构建和筛选利用前期制备的GPC3-N蛋白对羊驼进行六轮免疫后,从羊驼外周血中提取淋巴细胞,从淋巴细胞中提取m RNA;逆转录得到c DNA;设计合适引物,以c DNA为模板,进行两轮PCR得到纳米抗体基因序列;将目的基因克隆至噬菌体载体pComb 3XSS中;电击转化大肠杆菌ER2738感受态细胞,辅助噬菌体M13K07进行超染。以制备的GPC3-N蛋白为靶蛋白,利用噬菌体展示技术进行4轮富集淘选和单克隆筛选。经六次免疫后的羊驼血清效价达到1:32,000;获得了序列多样性良好的库容为6×10~7 cfu的抗GPC3-N纳米抗体文库;经辅助噬菌体M13K07扩增后噬菌体文库滴度约1×1013 pfu/m L,满足筛选需求;经过四轮条件苛刻的生物淘选后,获得了2个针对GPC3-N蛋白的纳米抗体噬菌粒。第四部分纳米抗体的表达和应用研究培养前期筛选得到的含有纳米抗体基因的菌株,提取质粒,经热激导入大肠杆菌TOP10F’感受态细胞,加入IPTG进行诱导表达后,经亲和层析纯化得到抗GPC3-N蛋白的纳米抗体。通过ELISA、Western blot、免疫荧光技术检测抗GPC3-N的纳米抗体与真核表达的GPC3蛋白和肝癌细胞Hep G2表达的GPC3的结合力。经SDS-PAGE电泳鉴定,表达的蛋白分子量大小为19 k D;纯化后的具有生物活性的纳米抗体的纯度达到95%以上;具有很好的免疫活性和免疫反应性,不仅能识别商品化全长GPC3也能特异性识别肝癌细胞Hep G2表面表达的天然GPC3蛋白。综上所述,本研究得到了纯度较高的GPC3-N蛋白;得到了针对GPC3蛋白的多克隆抗体;构建了一个库容为6×10~7 cfu的免疫纳米抗体文库;得到了针对GPC3蛋白的纳米抗体。这为后期改造纳米抗体建立肝癌早期诊断方法和实现分子靶向治疗提供了必要的实验基础。
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