【摘 要】
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低致病性禽流感病毒（Low pathogenic avian influenza virus,LPAIV）感染鸡后通常会导致养殖业的经济损失,并对人类健康造成一定威胁。家禽疫苗的接种是控制禽流感感染和传播的重要策略,目前常用的禽流感疫苗仍然是灭活的全病毒疫苗,由于灭活的全病毒疫苗主要诱导体液免疫反应,其抗体产生速度较慢,不能诱导有效的细胞免疫,且研究表明有效的疫苗除了抗原外需要选择适当的佐剂以激活
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低致病性禽流感病毒（Low pathogenic avian influenza virus,LPAIV）感染鸡后通常会导致养殖业的经济损失,并对人类健康造成一定威胁。家禽疫苗的接种是控制禽流感感染和传播的重要策略,目前常用的禽流感疫苗仍然是灭活的全病毒疫苗,由于灭活的全病毒疫苗主要诱导体液免疫反应,其抗体产生速度较慢,不能诱导有效的细胞免疫,且研究表明有效的疫苗除了抗原外需要选择适当的佐剂以激活相应的免疫应答,因此佐剂的使用对增强灭活苗的免疫效力和细胞免疫应答显得至关重要。本研究以鞭毛蛋白（FliC）和聚乙烯亚胺（PEI）两种免疫佐剂作为研究对象,并分别用真核、原核表达系统对蛋白佐剂FliC的表达和纯化进行了探索,将制备的佐剂分别配合H9N2禽流感灭活病毒进行皮下免疫,并设置H9N2商品化灭活苗做对照,以SPF鸡为动物模型比较不同佐剂的免疫增强效果。主要研究内容分为以下几部分:1.FliC蛋白的真核、原核表达及纯化通过NCBI基因库对比分析确定鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白（FliC）序列,并分别通过真核、原核蛋白表达系统进行目的蛋白的表达和纯化,具体内容如下:分别将目的基因FliC成功插入到真核表达载体p Fast BacTM 1和原核表达载体p ET-32a中,经进一步构建表达目的蛋白FliC-B（昆虫杆状病毒表达系统表达的FliC蛋白）和FliC-E（大肠杆菌表达系统表达的FliC蛋白）。将表达的FliC蛋白经SDS-PAGE及Western-Blot分析鉴定,结果显示FliC-B蛋白大小约为54 k Da,FliC-E蛋白大小约为62 k Da,且蛋白均大部分释放在上清液中,并能与His标签单克隆抗体反应,表现出良好的反应原性。将FliC-B蛋白和FliC-E蛋白进行镍柱纯化后获得大量目的蛋白。2.H9N2禽流感灭活疫苗的制备参考文献将佐剂终含量确定为20μg/0.3 m L,并按照H9N2商品化灭活苗所含病毒含量(即每0.1 ml病毒灭活前含量≥5×10~7 EID50)进行H9N2禽流感灭活疫苗的配置,具体如下:将H9N2禽流感病毒用福尔马林进行灭活,取灭活的H9N2禽流感病毒分别与FliC-B蛋白、FliC-E蛋白和PEI佐剂以体积比13:2进行混合作为水相,将疫苗水相与SEPPIC MONTANIDETM ISA 201VG佐剂按照体积比1:1进行乳化,得到H9N2禽流感灭活疫苗。3.FliC及PEI佐剂对H9N2禽流感灭活疫苗的免疫增强效果比较以2周龄SPF鸡为动物模型,将其分为以下5组:PBS组、H9N2商品化灭活苗组、H9N2+FliC-B组、H9N2+FliC-E组、H9N2+PEI组,按照每只鸡免疫剂量为0.3m L,通过检测每组体液和细胞免疫应答水平比较其佐剂活性。通过检测免疫后3周内血清HI抗体效价结果显示,免疫后1周,不同佐剂的添加均能快速引起机体的体液免疫应答,HI抗体效价均在2~4以上,与H9N2商品化灭活苗组相比差异极显著（P＜0.01）;不同佐剂组相比,PEI的体液免疫激活效力最强,FliC-E组最弱,且两组之间HI抗体效价差异显著（P＜0.05）。免疫后24 h检测鸡脾脏前炎性细胞因子表达结果显示,H9N2+FliC-B组的前炎性细胞因子表达水平略高于其他几组,但无统计学差异。免疫后3周分离外周血淋巴细胞检测淋巴细胞增殖结果显示,与PBS组相比,H9N2+FliC-E组可显著提高鸡外周血淋巴细胞的特异性增殖,为PBS组的1.7倍（P＜0.05）,H9N2+FliC-B组的增殖指数更高,为PBS组的3.0倍（P＜0.01）;IFN-γ细胞因子m RNA检测结果显示,H9N2+PEI组IFN-γ的m RNA表达水平相比PBS组和H9N2商品化灭活苗组有明显提升,分别为3.0倍和3.1倍,差异显著（P＜0.05）。综上,不同佐剂配合的H9N2禽流感灭活苗在体液和细胞免疫方面均显示出良好的佐剂活性,其中PEI在诱导体液免疫方面较FliC-E显示出更大的潜力。本研究分别利用真核、原核蛋白表达系统成功制备了FliC蛋白,并评估了不同佐剂配合H9N2禽流感灭活苗的免疫增强效果,不仅为蛋白类佐剂的制备方式提供一定的参考,也为除灭活苗外其他低免疫原性疫苗在配置中免疫佐剂的使用提供新的方案。
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