【摘 要】
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猪病毒性腹泻病一直以来都是困扰世界养猪业健康发展的主要障碍之一,给养猪业带来了巨大的经济损失。猪急性腹泻综合征冠状病毒（Swine Acute Diarrhea Syndrome Coronavirus,SADS-CoV）、猪传染性胃肠炎病毒（Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV）、猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Di
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猪病毒性腹泻病一直以来都是困扰世界养猪业健康发展的主要障碍之一,给养猪业带来了巨大的经济损失。猪急性腹泻综合征冠状病毒（Swine Acute Diarrhea Syndrome Coronavirus,SADS-CoV）、猪传染性胃肠炎病毒（Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV）、猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）、猪丁型冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus,PDCoV）和猪轮状病毒（Porcine Rotavirus,Po RV）是一类可以引起仔猪腹泻的病毒,致死率较高,并且常常表现为几种病原的混合感染。为了区分引起仔猪腹泻的几种病毒,本研究分别建立了检测五种腹泻病毒的单项DPO-RT-PCR方法和五重DPO-RT-PCR方法。单项DPO-RT-PCR方法在退火温度40℃～60℃均能扩增出明亮的目的条带。SADS-CoV、TGEV、PEDV、PDCoV和Po RV的最佳DPO引物浓度分别为0.2μm/L、0.2μm/L、0.2μm/L、0.3μm/L和0.3μm/L。用上述方法对PRCV、PTV和PPV病毒核酸进行扩增,结果均为阴性。SADS-CoV、TGEV、PEDV、PDCoV和Po RV的最低检测限分别为6.12×10~3 copies/μL、8.88×10~3 copies/μL、6.84×10~3 copies/μL、7.47×10~3copies/μL和6.51×10~3 copies/μL。在确定了单项DPO-RT-PCR反应条件的前提下,进行五重DPO-RT-PCR方法的优化,确定了SADS-CoV、TGEV、PEDV、PDCoV和Po RV的最佳DPO引物浓度分别为0.4μm/L、0.2μm/L、0.3μm/L、0.2μm/L和0.4μm/L。五重DPO-RT-PCR退火温度的优化结果表明,DPO引物对退火温度不敏感,而常规引物存在最适退火温度。五重DPO-RT-PCR特异性试验分别用一对DPO引物对五种病毒模板混合物进行扩增;将五对DPO引物的混合物分别应用五种病毒的c DNA,进行扩增;在同一反应中五种DPO引物同时加入,模板为五种病毒混合阳性质粒的混合物,PRCV、SVV、APPV、PCV3、PPV、PTV和PRRSV病毒c DNA,结果表明具有良好的特异性。敏感性表明SADS-CoV、TGEV、PEDV、PDCoV和Po RV的最低检测含量分别为6.12×10~4 copies/μL、8.88×10~3 copies/μL、6.84×10~3 copies/μL、7.47×10~3 copies/μL和6.51×10~4 copies/μL。该检测方法应用于临床样品检测,具有特异性好、灵敏度高的优点,因此可以用于猪相关腹泻病毒的诊断。利用建立好的五重DPO-RT-PCR检测方法对采集于华南地区2012～2018年的315份疑似腹泻样品进行了SADS-CoV流行病学调查。调查结果为SADS-CoV感染率为8.89%（28/315）,其中有7份是单独感染,其余21份是与其他1～3种病原混合感染。结果表明,2015年10月以后SADS-CoV在广东地区已经存在,而其他地区均未检测到SADS-CoV。临床混合感染中SADS-CoV与PEDV的混合感染率最高,为71.43%（20/28）。本研究对SADS-CoV阳性样品的全基因、S基因和N基因进行扩增测序,共获得了2个全基因组序列、4个S基因序列和4个N基因序列,并进行遗传演化分析和基因重组分析。测序结果表明,获得的SADS-CoV基因序列与NCBI数据库中的部分代表参考毒株核苷酸同源性在99.6%以上,没有发生较大的基因变异,与蝙蝠冠状病毒HKU-2亲缘关系较近。S基因与蝙蝠冠状病毒HKU-2株S基因的核苷酸同源性较其他基因低,仅为79.85%。全基因基因重组分析结果表明,本研究获得的全基因与相关蝙蝠冠状病毒和其他常见猪腹泻病毒参考序列未发生重组。本研究为更全面了解SADS-CoV在华南地区的分布情况以及流行趋势提供了一定的理论参考,为SADS-CoV的流行病学研究提供技术支撑和科学数据。
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