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禽流感(Avian Influenza)是由A型流感病毒引起的,属于正粘病毒科,负链单股RNA病毒,普遍存在于禽类、人类及其他的动物中,血凝素是禽流感疫苗重要的蛋白质,是亚单位疫苗中常用的抗原成分。本试验中H5HA10由H5N1(内蒙古/10/2009由部分)亚型流感病毒血凝素基因经设计后截短的片段,该片段在血凝素抗原变异方面具有重要作用。试验将Spyligase技术应用于禽流感亚单位疫苗的表面抗原H5HA10的高效制备,将H5HA10序列的两端分别加上Spy Tag和KTag,命名为Spy-H5HA10,利用Spyligase技术将其形成多聚体蛋白,增加H5HA10的稳定性。构建九个带有不同可溶性标签的Spy-H5HA10重组表达载体,分别在大肠杆菌中表达,选择表达量高的重组蛋白。将Spyligase连接在带有His-Cherry标签的p ET21b载体上,在大肠杆菌中表达。首先,使用Bam H I和Xho I双酶切获得目的基因Spy-H5HA10,将其连接在九种带有不同促溶性标签的载体上,分别将其转化进BL21感受态细胞中,Xho I和Nde I双酶切鉴定正确后,经IPTG诱导,通过SDS-PAGE电泳对融合蛋白的表达量和可溶性进行分析,筛选出表达量高可溶性好的促溶标签,其中p ET21b-His-Ars C-H5HA10蛋白的可溶性表达水平超过了95%。用同样的方法,Nhe I和Xho I双酶切获得目的基因Spyligase,将其连接在带有His-Cherry的可溶性标签的p ET21b载体上,转化进入BL21感受态细胞中,Xho I和Nde I双酶切鉴定正确后,经IPTG诱导,通过SDS-PAGE电泳分析其融合蛋白的表达量和可溶性,其表达量高可溶性好。其次,将p ET21b-His-Ars C-H5HA10和p ET21b-His-Cherry-Spyligas通过Ni-NTA Agarose亲和纯化,并获得了高纯度的Spy-H5HA10和Spyligase重组蛋白。最后,将获得高纯度的Spy-H5HA10与Spyligase混合后,在4℃PCT缓冲液中反应,通过SDS-PAGE电泳分析Spy-H5HA10形成单聚体,二聚体甚至是多聚体。本试验成功构建了九种不同促溶性标签的H5HA10的重组载体,一种含有可溶性标签的Spyligase重组载体;摸索并成功地获得高纯度的重组蛋白;重组蛋白形成多聚体蛋白;探究Spyligase技术的实用性,为禽流感亚单位疫苗的后续研究奠定了试验基础。