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白酒糟是白酒酿造过程的副产物,价格低廉,来源广泛,适口性较好,且富含大量营养物质,是传统的牛羊饲料原料。但白酒糟(湿)成分复杂,除含有丰富的营养物质外,还存在乙醇、甲醇、杂醇油、醛类、酸类等毒性成分。在牛羊养殖生产中,酒糟的使用量较大、饲喂时间长,易引起酒糟中毒性物质慢性累积,损害动物机体健康,导致酒糟慢性中毒发生,严重影响养殖生产效益,相关报道也较多。由于动物慢性酒糟中毒发病缓慢,疾病早期症状表现不明显,很难作出早期诊断;而且,已有的资料尚未有慢性酒糟中毒山羊血液生化指标、血液代谢物种类和含量变化的记载,酒糟中主要毒性物质引发山羊中毒的机制也不清楚。为此,本试验通过饲粮中添加65%、75%的鲜白酒糟及65%的储存白酒糟饲喂山羊,复制慢性酒糟中毒模型,采用血液生化指标、代谢组学分析及检测乙醇代谢途径中调控多巴胺的关键酶m RNA表达水平,探讨山羊白酒糟中毒的部分机制,发现疾病诊断的关键指标,为反刍兽养殖生产中白酒糟中毒病的高效防治提供部分理论依据。本试验的动物为本地杂交山羊24头,4月龄,公母各半,体重(27.02±3.03kg)及体况相近。采用单因素试验设计,将参试羊随机分为Ⅰ~Ⅳ组,6只/组。试验Ⅰ、Ⅱ组分别饲喂添加65%、75%鲜酒糟的饲粮,试验Ⅲ组饲喂添加65%储存酒糟的饲粮,试验Ⅳ组作对照饲喂基础饲粮。饲粮中能量及蛋白水平设计参考《肉羊饲养标准》(NY/T816-2004)。每只羊独立圈舍,半漏缝式地板,自由饮水,分别于每日9:00和18:00喂料。预试期14 d,正式试验期90 d。期间定期进行疫苗接种、驱虫、环境消毒等。分别于试验第15、30、45、60、75、90d采集参试羊静脉血样,测定血液中蛋白、钙磷、肝肾功等指标,微板法、酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定血清中乙醇、乙酸、乳酸含量。分别采集试验第90d的Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ组羊血样,采用非靶向代谢组学超高效液相串联四极杆飞行时间二级质谱(UHPLC-QTOFMS)平台及相关分析软件进行代谢物测定与差异代谢物分析。采集试验第90dⅡ、Ⅳ组羊肝脏组织,用q PCR的方法检测TH、DDC、SLC18A2、MAOA、DAT等乙醇代谢通路上关键基因的表达水平。结果显示:山羊在试验期中先后出现腹泻、便秘;支气管炎,神经异常兴奋,口流白沫、共济失调等消化、呼吸、神经系统症状。病理变化如肠粘膜出血充血、肝肾肿胀,质地脆弱等。在与实验室检验方法结合后,以确定造模成功。(1)第15d时,Ⅰ、Ⅱ组中乙酸、乙醇含量均显著高于Ⅳ组;第30d时,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组中UREA、乙酸含量均显著高于Ⅳ组,Ⅰ、Ⅱ组中ALB含量显著高于Ⅳ组,Ⅲ组中CREA含量显著高于Ⅳ组;第45d时,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组中ALB、UREA含量均显著高于Ⅳ组,Ⅱ、Ⅲ组中P含量显著高于Ⅳ组,Ⅰ、Ⅲ组中CREA含量显著高于Ⅳ组,Ⅲ组中乙醇含量显著高于Ⅳ组;第60d时,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组中UREA、乙酸含量均显著高于Ⅳ组,Ⅱ、Ⅲ组中AST含量显著高于Ⅳ组,Ⅲ组中CREA含量显著高于Ⅳ组;第75d时,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组中UREA、乙醇、乙酸含量均显著高于Ⅳ组,Ⅲ组中ALT、AST含量均显著高于Ⅳ组,Ⅱ组中P含量显著高于Ⅳ组;第90d时,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组中乙酸含量显著高于Ⅳ组,Ⅲ组中ALT、AST、乙醇含量均显著高于Ⅳ组。其中在45d、60d、75d、90d时,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组中Ca含量均显著低于Ⅳ组。说明添加鲜酒糟可使试验羊血清白蛋白含量升高,添加新鲜、贮存酒糟导致羊钙磷代谢紊乱,肝、肾功能受损。(2)非靶向代谢组学研究,Ⅰ组与Ⅳ组比较,出现了340个差异代谢物,其中186个代谢物上调,154个代谢物下调。Ⅱ组与Ⅳ组比较,出现了315个差异代谢物,其中142个代谢物上调,173个代谢物下调。比较两个试验组与对照组差异代谢物,多巴胺与2-呋喃酰甘氨酸的显著上调、前列腺素I2的显著下调,可能为山羊酒糟慢性中毒诊断的潜在性生物标志物。KEGG代谢通路富集分析,这些差异代谢物涉及到18个显著变化的代谢通路,主要包括突触小泡周期、多巴胺能突触、乙醇中毒、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、组氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、三羧酸循环、鞘脂信号通路、c AMP信号通路。其中,乙醇中毒、可卡因成瘾这两个代谢途径在三组两两比较中均变化显著,且影响因子>0.2。说明添加鲜酒糟对山羊体内乙醇中毒、可卡因成瘾两个代谢途径均有显著影响。(3)q-PCR试验结果,与对照组比较,TH在Ⅱ组中的表达量显著降低(p<0.05);DDC、MAOA、DAT的表达量也呈降低趋势,但无显著性差异(p>0.05);SLC18A2在两组间的表达水平相当且无显著性差异(p>0.05)。说明添加鲜酒糟可抑制羊肝组织中TH、DAT的表达,加速多巴胺的产生并使细胞中的DA含量增加,进而引起羊酒精中毒,表现精神活动紊乱。结论:饲粮长期添加较高剂量酒糟可造成山羊慢性中毒,使其肝脏和肾脏损害,发生钙磷代谢紊乱以及乙醇代谢紊乱。非靶向代谢组学分析,酒糟慢性中毒可导致机体多巴胺与2-呋喃酰甘氨酸显著上调、前列腺素I2显著下调,对山羊体内乙醇中毒、可卡因成瘾两个代谢途径影响较大,多巴胺、2-呋喃酰甘氨酸、前列腺素I2可能为该病诊断的潜在性生物标志物。长期添加鲜酒糟可抑制羊肝组织中TH、DAT的m RNA表达水平,使细胞中的多巴胺含量增加,引起酒糟中毒山羊的神经系统紊乱。