防御素是一种在先天免疫和适应性免疫中发挥了极其重要的作用的抗菌肽。近年来新的研究工作正在不断地丰富人类对它们生物学功能的全面认识。例如,我们课题组2015年以来首次报道了真菌防御素和人源防御素能够抑制T细胞膜上钾离子通道Kv1.3电流,调节细胞因子分泌的功能（Feng,Yang et al.2015,Xiang,Xie et al.2015,Xie,Feng et al.2015,Yang,Feng et al.2015）。鉴于防御素广泛分布在真菌、植物、无脊椎动物和脊椎动物中,本论文拟创新开展无脊椎动物蝎防御素和深入开展脊椎动物人防御素的新功能与机制研究。蝎在四亿多年前完成了由带有尖刺尾针的海蝎到与现生蝎相似毒腺水蝎的自然进化,随后进一步进化为陆生动物,因而被称为“活化石”。蝎子作为众所周知的有毒动物,其神经毒素的分子进化一直是科学界中活跃的科学问题。鉴于蝎毒液器官“从无到有”的进化历程和蝎防御素与经典蝎神经毒素的氨基酸残基序列相似性,我们推测蝎血淋巴循环系统及其中的防御素组分在蝎神经毒素的分子进化过程中发挥了极其重要的作用。在调查蝎防御素与蝎神经毒素的关系之前,我们首先开展了蝎防御素的抗微生物功能研究。基于我们研究团队先前发现的6个东亚钳蝎防御素基因（Cao,Yu et al.2013）,通过原核表达技术和多肽的化学合成技术相结合,成功获得了3条蝎防御BmKDfsin3、BmKDfsin4和BmKDfsin5。抗菌活性实验表明3条蝎防御素均能有效地抑制革兰氏阳性菌的生长,如BmKDfsin3、BmKDfsin4和BmKDfsin5对S.sureus ATCC25923的MIC分别为2.5μM、0.08 μM和2.5μM。蝎防御素对耐药性菌株也展示了有效的抗菌活性,如BmKDfsin3、BmKDfsin4和BmKDfsin5对S.epidermis PRSEP1389的MIC分别为 1.25μM、0.31μM和 1.25μM。为了探索蝎防御素的抗菌机制,我们选择了BmKDfsin4对革兰氏阳性菌SsureusAB94004抗菌机制进行初步研究。实验发现了防御素BmKDfsin4通过使细菌细胞壁发生质壁分离,破坏细胞结构完整性最终导致细菌死亡。这些工作表明了蝎防御素BmKDfsin3、BmKDfsin4和BmKDfsin5具有典型防御素的抗菌功能特征,也说明了它们在蝎数亿年的生存和进化过程中发挥着它们与生俱来的基本功能。蝎毒腺器官“从无到有”的进化历程表明了蝎毒液中神经毒素分子是在防御素出现之后进化产生的。为了生存,早期海蝎通过持续使用其尖锐的尾刺慢慢地形成了水蝎的毒腺器官。如今现生蝎毒腺器官前面也可见一个显著的动脉和静脉血管。这些进化历程暗示了蝎血淋巴和防御素成份在蝎神经毒素的进化过程中发挥了重要角色。为了验证这一假设,我们在国际上率先调查了蝎血淋巴对细胞膜哺乳动物钾离子通道电流的影响。电生理实验吻合了我们的推测,1:10稀释的蝎血淋巴对钾离子通道Kv1.1、Kv1.2、Kv1.3和SK3电流抑制率分别为45.7%、82.8%、86.1%和52.8%,从而说明了蝎血淋巴中含有作用于钾离子通道的抑制剂。鉴于蝎防御素与经典蝎神经毒素的氨基酸残基序列的相似性,一方面,我们运用NMR结构测定技术解析了蝎防御素BmKDfsin3的结构,发现它与经典蝎神经毒素具有显著的结构相似性。三维结构是由α螺旋和反向平行的β折叠二级结构组成的空间结构,并且这种空间结构由三对配对方式相同的二硫键稳定。另一方面,膜片钳实验显示了蝎防御素BmKDfsin3、BmKDfsin4和BmKDfsin5对钾离子通道的电流具有差异性抑制作用。蝎防御素BmKDfsin3对钾离子通道Kv1.1、Kv1.2、Kv1.3和SK3均有不同程度的抑制活性,其中对钾离子通道Kv 1.3的半数抑制浓度IC50值为23.4nM。蝎防御素BmKDfsin4对钾离子通道Kv1.1、Kv1.2、Kv1.3电流都具有一定的抑制效果,其中对钾离子通道Kv1.3的抑制活性IC50为510.2 nM;蝎防御素BmKDfsin5只对钾离子通道SK3具有抑制活性,1 μMBmKDfsin5可以抑制46.3%的SK3通道电流。这些结果第一次表明蝎防御素能够与经典的蝎神经毒素一样能够抑制钾离子通道电流。除了蝎防御素与经典神经毒素的功能相似性外,我们进一步研究了蝎防御素和经典神经毒素作用钾离子通道分子机制的差异。钾离子通道嵌合体的实验表明BmKDfsin3通过识别钾离子通道Kv1.3孔区部分抑制钾离子通道电流。钾离子通道的点突变实验进一步表明蝎防御素BmKDfsin4也是通过钾离子通道Kv1.3孔区发生相互作用。通过对蝎防御素BmKDfsiin4主要碱性氨基酸残基进行丙氨酸扫描突变试验,发现了K13、R19和R21是影响防御素活性的主要功能性氨基酸残基,其中K13是钾离子通道Kv1.3“堵孔”的氨基酸残基。这些结果也同样表明了蝎防御素具有与经典神经毒素作用于钾离子通道一样的分子相互作用机制,即通过作用于钾离子通道孔区部分抑制钾离子通道电流。综合分析蝎血淋巴对钾离子通道的活性、蝎防御素与神经毒素的结构-功能相似性,本论文的工作为防御素进化为神经毒素提供了有力的实验证据。近年来我们发现人防御素与T细胞膜钾离子通道Kv1.3的相互作用（Xie,Feng et al.2015,Yang,Feng et al.2015）,说明了防御素的生物学功能超出了我们的想象。为了进一步探索人防御素的功能,我们选择了糖尿病足的慢性创面进行初步研究。通过对糖尿病足患者的临床样本进行调查发现发现人内源α和β防御素在创面呈现特征性分布,其中α防御素在糖尿病足创面中心的表达高于创面周边,而β防御素则是在创面周边的表达高于创面中心。糖尿病患者由于长期高糖在体内会积累很多的糖基化产物（AGEs）,我们发现在糖基化产物存在的情况下,糖尿病足创面中心高表达的α防御素HNP1和HNP4与糖基化产物AGE-BSA共同促进成纤维细胞促炎因子IL8的分泌,而单独的HNP1和HNP4不能促进促炎因子IL8分泌。这个差异现象表明了在病理条件下,人内源α防御素除了在慢性创面发挥抗微生物功能外,它们与成纤维细胞的作用进一步加剧了糖尿病患者创面的炎症反应,进一步导致创面的难以愈合。为了探讨人α防御素影响炎症因子IL8分泌的机制,Western Blot实验发现防御素HNP1与糖基化产物一起通过促进NF-κB-P65（Ser536）磷酸化调节炎症因子IL8的分泌。这些工作不仅发现了人防御素在糖尿病足创面的特征性分布及其病理功能,同时提高了对防御素在病理条件下免疫功能的认识。综上所述,本论文开展了蝎和人防御素的新生物学功能与机制研究,一方面为蝎神经毒素的分子进化提供了实验证据,另一方面进一步揭开了糖尿病足慢性创面难以愈合的机理。这些工作为进一步推动不同类型动物防御素的生物学功能的系统认识与应用奠定了基础。