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蛇毒中含有较多的影响血液系统功能的活性组分,如:凝血酶样酶、解离素、纤溶酶、纤溶酶原激活剂、凝血Ⅹ因子激活剂等,特别是在蝮科和蝰科蛇毒中尤为突出。1993年,中科院昆明动物研究所的张云等[1]首先报道从竹叶青蛇(Trimeresurus stejnegeri)蛇毒中分离纯化出具有激活纤溶酶原作用的蛋白酶(TSV-PA),以及对TSV-PA的大量后续研究,为新型溶栓药物的开发提供了新的思路。本实验室已成功从江浙短尾蝮(Gloydius brevicaudus)蛇毒中分离纯化出短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂(plasminogen activator of Gloydius brevicaudus venom, GBV-PA),并通过动物实验证实它对动物实验性血栓具有治疗和预防作用。为了全面了解GBV-PA的药理学特点,本课题拟研究在动物体内的药物代谢动力学,为进一步的开发研究提供初步的药代动力学数据。1. GBV-PA的分离纯化及部分理化性质测定[1] GBV-PA的分离纯化短尾蝮粗蛇毒用苯甲脒-琼脂糖凝胶(Benzamidine Sepharose 6B)亲和层析,得到两个蛋白峰,收集具有酶活性的第二峰,经浓缩后再用Superdex G-75凝胶过滤层析进一步纯化,得到3个蛋白峰,经纤维蛋白平板法鉴定第Ⅱ峰的降支具有激活纤溶酶原,间接溶解纤维蛋白的作用,该组分再过Lichrospher C18 4.6/250反相色谱柱,得到纯品GBV-PA。[2] GBV-PA的理化性质GBV-PA经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。在β-巯基乙醇还原和非还原条件下,均显示单一条带,即其为单一肽链的蛋白质,分子量为40kDa左右。2. GBV-PA抗体的分离纯化及部分理化性质测定[1] GBV-PA抗体的分离纯化应用已活化的CNBr-activated Sepharose 4B琼脂糖凝胶与GBV-PA反应,将GBV-PA偶联在琼脂糖凝胶的活化臂上,再用亲和层析的原理,用自制的琼脂糖凝胶分离纯化蝮蛇毒抗血清,得到两个蛋白峰并收集第二个蛋白峰。[2] GBV-PA抗体的理化性质GBV-PA抗体与短尾蝮粗蛇毒经苯甲脒-琼脂糖亲和层析后的第二峰和纯品经双向免疫扩散活后,可见清晰的免疫沉淀线,且各沉淀线之间互相融合。3.抑制性BA-ELISA测定GBV-PA血药浓度3.1抑制性BA-ELISA检测方法采用96孔酶标板,每孔加入含有GBV-PA的包被缓冲液100μl包板,4℃过夜,用洗涤缓冲液(PBST)洗涤三次,每次3min后,加入封闭缓冲液含100μl/孔,37℃封闭120min,PBST洗涤。同时经适当稀释后的待测样品与定量抗体置37℃,孵育120min后,每孔加入反应后的样品,100μl/孔,37℃温育120min,PBST洗涤。再加入生物素标记的二抗,37℃孵育120min,PBST洗涤,加入HRP标记的亲和素,37℃反应40min后,加入邻苯二胺(OPD)底物100μl/孔显色,37℃,30min后立即加入2mol/L硫酸50μl终止反应,于30min内用MultiskanMK3型酶标仪测定A492nm值。3.2最适包被抗原浓度固定GBV-PA抗体、二抗及亲和素-HRP的浓度,用包被缓冲液配成系列稀释的抗原溶液,按上述流程进行ELISA测定。以含GBV-PA抗体而不含GBV-PA的Beagle犬血浆的A492nm值为1.5,不含GBV-PA抗体也不含GBV-PA血浆的A492nm值最小时的包被抗原浓度为最佳包被浓度,则最佳包被抗原浓度为0.5μg/ml。3.3最适GBV-PA抗体浓度固定GBV-PA、二抗和亲和素-HRP的浓度,用稀释缓冲液配成系列稀释的GBV-PA抗体溶液,操作同上。以含GBV-PA抗体而不含GBV-PA的Beagle犬血浆的A492nm值为1.5,不含GBV-PA抗体也不含GBV-PA血浆的A492nm值最小时的包被抗原浓度为最佳包被浓度,则最佳抗体浓度为0.6×10-3U/ml3.4标准曲线的建立及灵敏度检测用20倍稀释后的空白Beagle犬血浆系列稀释GBV-PA,在包被抗原浓度为0.5μg/ml,抗体浓度为0.6×10-3U/ml的条件下进行ELISA测定,所得△A 492nm值与GBV-PA的对数剂量进行直线回归,在抗原为1ng/ml～32ng/ml的线性范围内,标准曲线为:y=0.3173x+0.3491,r=0.9927。检测水平达到1ng/ml。4.血样、胆汁和尿液的采集4.1 Beagle犬血样的收集和检测Beagle犬36只,雌雄兼用,分为单次静脉给药组和动脉局部给药组,前者分别静注GBV-PA 75和300μg/kg,后者分别大脑中动脉内注射GBV-PA 18.75、37.5和75μg/kg,每一剂量组6只。Beagle犬静脉注射戊巴比妥钠30μg/kg麻醉,静注肝素3125U/kg体内抗凝。静脉给药组在耳缘静脉给药,在股动脉插管处取血,在给药后立即计时,按不同时间点采集血液标本。局部给药组为大脑中动脉给药,通过介入术,在股动脉插管,并在股动脉插管处取血,给药时间为10min,给药后立即计时,按不同时间点采集血液标本,低温离心(3000rpm)10min,取上清液用PBS作适当稀释。Beagle犬静脉注射GBV-PA 300μg/kg和75μg/kg的体内过程符合二室开放模型,t1/2α分别为3min和7min,t1/2β分别为5861min和5107min。表观分布容积分别为0.25L/kg和0.3L/kg。其药—时分别为C(t)=1815e-0.2181t+107e-0.0046t和C(t)=4897e-0.1862t+39e-0.0056t。动脉局部推注75μg/kg、37.5μg/k和18.75μg/kg后,Cmax分别为6472ng/ml、1413ng/ml和1442ng/ml,tpeak为15min。4.2大鼠胆汁尿液的收集和检测大鼠6只,雌雄兼用,静脉注射乌拉坦0.16mg/kg麻醉,仰卧位固定于大鼠手术台上,给药前,在左股静脉处留置插管,持续静脉滴注生理盐水30ml/kg·h-1,胆总管插管,膀胱插管引流胆汁和尿液。右股静脉注射GBV-PA 300μg/kg后,分段收集胆汁和尿液。收集尿液时,每段时间间隔收集尿液前用手挤压膀胱使其排空以尽量减少死腔,每段收集10min。取上清液用PBS做适当稀释,测得GBV-PA主要经肾脏排泄,1h从尿中排出的GBV-PA相同抗原性物质的量为7.06%,4h的排出量为12.78%。经胆汁排出的GBV-PA较少,给药后4h的排出量仅为0.005%。结论:抑制性BA-ELISA检测GBV-PA的方法,灵敏度达1ng/ml。Beagle犬动脉局部给药后,血药浓度先快速上升,在15min达峰,75μg/kg动脉给药组的达峰浓度较75μg/kg静脉给药组高,这于药效学研究的结果呈现明显的一致性。之后以一级消除速率从体内清除,动脉内局部给药是有效的给药途径之一。