背景:念珠菌是人体内最常见的机会性致病真菌,由其感染引起的疾病统称为念珠菌病。这是一种由遗传、免疫和环境因素共同参与的慢性炎症性疾病,有较高的发病率,这已经严重影响着人们的生活。而念珠菌病中最常见的是白念珠菌感染,占据了感染病例的一半以上。对于正常人来说,白念珠菌一般不会引起疾病或仅引起轻微的浅表感染。但是当人体免疫系统受损时,白念珠菌会引起较严重的深部感染,甚至导致致命性的侵袭性感染。因此,阐明白念珠菌的致病机制对于临床上治疗白念珠菌病而言显得尤为重要。钙离子稳态与宿主抗感染、应答外界环境压力和耐药性等密切相关。然而目前对钙离子以及相应信号通路了解仍然比较少。我们通过筛选白念珠菌基因敲除文库发现了KRE5基因参与调控白念珠菌响应高浓度钙离子胁迫。KRE5基因编码一个含有C端内质网滞留信号的管腔内质网蛋白,被认为是一种参与β-1,6-葡聚糖合成的葡萄糖转移酶,在细胞壁的形成中扮演着重要作用。而钙调磷酸酶信号通路是白念珠菌应答高钙条件和参与真菌致病的重要信号途径,该通路受到转录因子Crz1的调控。有文献报道Crz1与棘白菌素类药物的耐药性密切相关,这提示钙调磷酸酶信号通路与白念珠菌的耐药性存在一定的联系。KRE5基因与细胞壁的形成密切相关,而宿主主要是通过识别细胞壁成分来辨别白念珠菌从而激活各种免疫反应,达到对白念珠菌进行清除的目的。因此KRE5基因可能与细胞壁形成、钙离子调控、耐药性及宿主对白念珠菌的免疫应答有关,但是具体作用和机制还不清楚。目的:本研究拟建立KRE5的敲除株与回补株以及钙调磷酸酶信号通路上的重要调控因子Crz1的敲除株与加标签菌株,研究KRE5与钙离子信号通路的关系,并在加米卡芬净后来检测KRE5基因参与白念珠菌的耐药性及相关机制。用白念珠菌刺激巨噬细胞后检测炎症因子的表达情况并感染小鼠观察生存率,从而探讨KRE5基因与机体抵抗白念珠菌感染的免疫应答的关系,为抗真菌药物的筛选提供靶点。方法:1.基于白念珠菌基因敲除株文库筛选钙离子敏感菌株,筛选到6个基因对高钙离子呈现出敏感性,进一步进行滴板验证表型。本课题主要聚焦于KRE5基因。2.构建敲除株与回补株并进行滴板实验证明KRE5基因影响细胞壁的完整性。我们用滴板的方法检测WT、kre5Δ/Δ和KRE5 AB白念珠菌的生长情况。为了进一步确定KRE5基因与菌丝的关系,我们在37℃的条件下分别在0、6 h用YPD、Spider、Serum诱导菌丝来观察KRE5敲除株的生长情况。3.验证KRE5基因敲除的白念珠菌生长是否还受其他离子的影响,我们用滴板的方法来检测白念珠菌的生长情况。4.采用同源重组的方法把Myc、HA标签加入WT、kre5Δ/Δ白念珠菌体内,通过Western-blot、RT-q PCR、免疫荧光等各种实验探究KRE5敲除株与钙离子相关转录因子Crz1的联系。5.KRE5基因与钙离子和Crz1之间主要通过钙调磷酸酶信号通路发挥作用,我们使用钙调磷酸酶信号通路上的调节亚基抑制剂来抑制钙调磷酸酶,用钙离子螯合剂来抑制钙离子,分别检测Crz1蛋白表达水平。取WT、kre5Δ/Δ、KRE5 AB（回补株）和crz1Δ/Δ单克隆白念珠菌过夜培养后转至新的YPD液体培养基中继续培养,培养至对数期取5×10~6个菌,Fluo-3,AM染色后用流式细胞术计数观察胞内钙离子水平。6.我们从WT、WT+钙离子（Ca）和kre5Δ/Δ白念珠菌中抽取RNA,进行RNA-seq测序,寻找差异表达基因来探讨KRE5作用的潜在机制并进行差异表达基因的验证。7.为研究KRE5与抗真菌药物的关系,我们检测了WT、kre5Δ/Δ和kre5Δ/Δcrz1Δ/Δ对米卡芬净药物的敏感性,并验证了与耐药性相关基因的表达情况。8.我们使用免疫荧光染色检测了WT、WT+Ca、kre5Δ/Δ和KRE5 AB细胞壁甘露聚糖、β-1.3葡聚糖和几丁质的表达情况,并用流式细胞术定量这几种成分的含量。9.我们使用WT和kre5Δ/Δ白念珠菌分别感染骨髓来源巨噬细胞（BMDM）和野生型小鼠,分别用RT-q PCR和ELISA检测促炎症细胞因子的表达水平,并观察小鼠感染后15天内的生存率。结果:1.KRE5基因响应高浓度钙离子胁迫钙离子稳态和钙调磷酸酶信号通路在真核细胞中高度保守,白念珠菌能利用细胞内存在的各种钙离子通道与各种离子进行交换从而维持机体的稳态。我们通过筛选基因敲除株文库对高钙离子的敏感性筛选到了6个基因,查阅文献可知KRE5基因与钙离子关系密切,因此本研究聚焦于KRE5基因。2.KRE5基因缺失后不利于维持白念珠菌细胞壁的完整性和菌丝的生成我们用滴板的方法检测WT、kre5Δ/Δ和KRE5 AB的生长情况,结果显示KRE5敲除株在各种培养基上生长迟缓,提示KRE5基因参与细胞壁的形成。为了进一步确定KRE5基因与菌丝的关系,我们在37℃的条件下分别在0、6 h用YPD、Spider、Serum诱导菌丝形成来观察KRE5敲除株的生长情况,结果显示不同于WT,KRE5敲除株菌丝基本不能形成。3.KRE5基因缺失后只参与对钙离子的调控KRE5基因以及钙调磷酸酶信号通路与白念珠菌的细胞壁有着密不可分的联系,我们配置了YPD,2 m M EGTA,5 m M EGTA,200 m M Ca2+,400 m M Ca2+,10 m M Fe3+,10 m M Mg2+,1 m M Zn2+培养基。用滴板的方法检测真菌的生长情况,结果显示KRE5敲除株白念珠菌主要对高钙敏感,但对其他离子不敏感。4.KRE5基因缺失后导致白念珠菌在没有钙离子刺激条件下显著促进Crz1表达Crz1作为钙调磷酸酶信号通路上的转录因子发挥着重要作用。我们通过Western-blot和RT-q PCR检测Crz1的表达量,结果发现KRE5基因缺失后能促进白念珠菌Crz1的表达。5.KRE5基因缺失后促进Crz1入核我们通过免疫荧光染色发现KRE5基因缺失后能促进白念珠菌的Crz1入核从而可能对下游的靶基因进行调控使其发挥生物学功能。6.KRE5基因缺失后导致Crz1的表达增加依赖于钙调神经磷酸酶我们使用荧光探针观察了WT、kre5Δ/Δ和KRE5 AB胞内钙离子水平,并对WT、kre5Δ/Δ和cnb1Δ/Δ白念珠菌给予钙调磷酸酶通路上调节亚基的抑制剂环孢菌素（CSA）、他克莫司（FK506）和钙离子螯合剂（EGTA、BAPTA）处理,通过Western-blot检测抑制钙调磷酸酶信号通路和抑制钙离子水平后白念珠菌的Crz1蛋白表达水平。结果显示KRE5敲除株胞内钙离子水平明显升高,而加入钙离子及其信号通路分子的抑制剂则部分抑制了Crz1的表达,提示钙离子部分参与了KRE5敲除上调Crz1的作用。7.KRE5基因缺失后促进了钙离子相关基因的表达我们把WT、WT+Ca和kre5Δ/Δ白念珠菌抽取RNA并进行RNA-seq分析,结果显示KRE5缺失后调控的基因与离子转移有关,提示kre5Δ/Δ可能与钙离子密切相关。RT-q PCR发现与对照相比,KRE5基因敲除株与钙离子相关的基因表达水平也明显升高,验证了KRE5基因的表达与钙离子密切相关。8.KRE5基因缺失后导致白念珠菌对棘白菌素类药物耐受RNA-Seq分析结果也显示部分与KRE5相关的差异性表达基因与耐药性有关。我们验证了WT和KRE5敲除株对于常见的抗真菌药物包括唑类,棘白素类和两性霉素B类的耐药性,结果发现KRE5基因缺失后增加了白念珠菌对棘白素类药物的耐药性而同时敲除Crz1则逆转了其耐药性,提示KRE5基因可能通过调控Crz1来影响白念珠菌的耐药性。与之一致的是,KRE5基因缺失后增强了与耐药性相关的基因的表达,而同时敲除Crz1则逆转了这些基因的表达。9.KRE5基因缺失后导致细胞壁几丁质、葡聚糖和甘露聚糖生成增加KRE5基因作为β-1,6-葡聚糖转移酶在细胞壁形成中扮演着重要作用,有研究显示白念珠菌主要通过识别细胞壁不同成分来激活免疫反应。所以我们对WT、WT+CAS、kre5Δ/Δ和KRE5 AB进行几丁质、葡聚糖和甘露聚糖细胞壁染色,结果显示KRE5的敲除导致细胞壁相关成分明显增高,而回补KRE5逆转了细胞壁相关成分的增加。10.KRE5基因参与调控病原与宿主的相互作用KRE5敲除株细胞壁相关成分明显升高,但毒力是否受到影响还未知。我们培养小鼠骨髓巨噬细胞,取对数期的白念珠菌刺激细胞,检测了TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平。结果显示相比于WT白念珠菌,KRE5敲除白念珠菌刺激明显增强了巨噬细胞炎症细胞因子的表达,说明KRE5敲除株可能更好地激活宿主的免疫反应。我们用WT和kre5Δ/Δ白念珠菌感染C57BL/6小鼠,观察其生存率。结果显示KRE5敲除株感染小鼠的生存率比WT菌株感染小鼠的生存率明显更高,提示KRE5基因的缺失增强机体的免疫反应,有助于机体对白念珠菌的清除。结论:1.KRE5基因主要参与钙离子而不是其他离子的调控。2.相对于WT,KRE5基因的敲除能导致Crz1的异常升高。3.KRE5基因缺失后导致Crz1的异常升高部分依赖于钙离子。4.KRE5基因缺失后导致白念珠菌对棘白菌素类药物出现耐药性,kre5Δ/Δcrz1Δ/Δ却显示敏感性,说明耐药性的出现与Crz1的增高密切相关。5.KRE5基因敲除促使细胞壁相关成分明显升高,且增加白念珠菌刺激巨噬细胞产生的炎症细胞因子。此外,KRE5基因敲除增加了宿主对真菌的抗性。这些结果说明KRE5基因的缺失导致胞内钙离子水平升高并通过钙调磷酸酶信号通路影响Crz1从而实现对棘白菌素类药物敏感性的调控,也激活先天免疫反应从而增强宿主对白念珠菌进行清除,这些研究有助于新型抗菌药物的研发。