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背景:乙型肝炎病毒（HBV）感染是导致肝癌发生的一个重要风险因素,我国HBV感染相关的肝细胞癌（HBV-HCC）的发病率与死亡率位居癌症谱前列。HBV-HCC病理学诊断的金标准为手术切除组织进行病理组织学或细胞学检查,为有创检查,无法对HBV-HCC患者进行早期诊断和后续肿瘤监测。液体活检作为一种无创的检查手段,现已被广泛应用于肿瘤的诊断和监测。临床应用较多的肿瘤液体活检标志物主要有游离循环肿瘤细胞（CTCs）和循环肿瘤DNA（ct DNA）。其中ct DNA是属于外周血游离DNA（cf DNA）的一种,除了ct DNA外,在cf DNA中还存在染色体外环状DNA（eccDNA）。现有报道表明eccDNA与癌症的发生发展密切相关,故外周血中的eccDNA有望作为一种新型液体活检标志物。目前外周血中eccDNA与HBV-HCC患者的联系尚不清楚。与ct DNA相比,eccDNA的结构比ct DNA更稳定,在血液循环中更不易被降解,故探索eccDNA在HBV和HBV-HCC患者中的差异,有望提供一种新型的液体活检生物标志物用于HBV-HCC的监测与诊断,从而更好的辅助临床对HBV-HCC患者进行早期干预治疗和监测,提高患者的生存率。目的:本研究旨在通过纳米孔高通量基因测序技术,鉴定HBV-HCC患者和HBV患者血浆样本中可能存在的eccDNA分子特征谱的差异,以阐明HBV-HCC患者外周血中存在的eccDNA分子的生物学特征,进一步分析其作为液体活检的新型生物标志物在HBV-HCC患者诊断中的临床意义。方法:本课题从赣州市第五人民医院肝病科就诊的患者中收集了12例血浆样本及相关临床病史资料。从中提取样本DNA,进行文库制备及上机测序。使用minimap2将测序数据与人源序列比对,提取匹配上人源序列的reads进行ecc＿RCA＿nanopore分析,鉴定eccDNA分子。同时,将样本的测序数据基于bedtools流程分析,获取eccDNA的生物学信息。HBV和HBV-HCC患者血浆样本中eccDNA分子特征谱差异,使用非配对样本t检验与单侧k-s检验,验证差异是否具有统计学意义。edge R分析（P值＜0.05和|log FC|＞1）HBV和HBV-HCC两组样本的eccDNA所在宿主基因的差异。使用R包及IGV软件对样本数据进行可视化。结果:1、HepG2细胞系与血浆中eccDNA检测方法的建立。HepG2细胞系样本中,从1033410条reads数中鉴定1082个eccDNA分子,分布于基因组不同染色体上,99.03%的eccDNA由一个片段组成。血浆样本中,从123936条reads中鉴定327个eccDNA分子,分布于基因组不同染色体上,99.34%的eccDNA由一个片段组成。2、HBV和HBV-HCC患者血浆中eccDNA检测。HBV和HBV-HCC患者血浆中鉴定多个eccDNA分子（2572-192425个eccDNA）,分布于基因组不同染色体上,绝大多数eccDNA分子由一个片段组成,仅有小部分eccDNA分子由两个或两个以上片段组成,且eccDNA分子长度主要分布在1 kb之内,表明该课题实验方法主要适合研究小分子量eccDNA分子特征谱（即micro DNA和spc DNA）。3、HBV和HBV-HCC患者血浆中eccDNA分子特征比较。1)数量差异:HBV-HCC患者血浆中eccDNA分子数更多,具有显著差异（P值为0.02）。2)占比差异:HBV-HCC患者血浆中检测的eccDNA分子占比更高,具有显著差异（P值为0.02）。3)分子长度差异:在500 bp之内的eccDNA分子中,HBV-HCC患者血浆样本eccDNA更长,具有显著差异,P值＜2e-16;＞500 bp的eccDNA分子中,HBV患者血浆eccDNA更长,具有显著差异,P值＜2.2e-16。4)分布差异:HBV-HCC患者血浆中检测到eccDNA分子比对到人类基因组区域更广泛。5)eccDNA所在宿主基因差异:HBV-HCC血浆样本中鉴定eccDNA所在宿主基因有7623个,HBV血浆样本中鉴定eccDNA所在宿主基因有1690个,且多个eccDNA分子只出现在HBV-HCC样本中。HBV患者血浆中eccDNA分子与尼古丁成瘾信号通路相关,HBV-HCC患者血浆中eccDNA分子与信号传导、细胞生长发育信号通路相关。eccDNA所在宿主基因进行edge R差异分析,发现129个差异eccDNA分子,25个下调,104个上调,差异eccDNA分子与信号转导和昼夜节律信号通路相关。4、片段滤过优化eccDNA分析流程:对总reads数进行片段滤过处理,分别滤过＜200bp、＜300bp……＜1600bp片段大小的reads后分析eccDNA的检出情况,发现滤过600 bp以下片段有利于提高eccDNA数据占比,eccDNA整体分子特征没有显著改变。结论:本课题建立了基于纳米孔基因测序技术检测血浆样本eccDNA的实验方法和分析流程,明确了HBV-HCC与HBV患者血浆中eccDNA分子特征差异。HBV-HCC患者血浆中eccDNA分子特征谱可作为肿瘤液体活检的新型生物标志物,有望用于临床HBV-HCC患者诊断和HBV高危人群发病风险的监测。