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目的:研究Cu@Fe3O4NPs对人胰腺癌细胞抑制作用,明确Cu@Fe3O4NPs通过生成ROS诱导PANC-1细胞凋亡的可能机制,初步评价Cu@Fe3O4NPs对小鼠的生物安全性。方法:1.利用CCK8法,研究Cu@Fe3O4NPs对人胰腺癌PANC-1和CFPAC-1细胞增殖活力的影响,计算细胞增殖抑制率和半数抑制浓度,明确Cu@Fe3O4NPs对人胰腺癌细胞抑制的剂量-效应关系和时间-效应关系。2.利用人源CFPAC-1细胞异种移植瘤裸鼠模型,研究Cu@Fe3O4NPs对胰腺癌生长的影响,绘制肿瘤生长曲线,计算抑瘤率,明确Cu@Fe3O4NPs对人胰腺癌的抑制作用。3.在化学水平上,利用结晶紫分光光度法测定芬顿反应产生的羟自由基,研究Cu@Fe3O4NPs基于芬顿反应的ROS生成。4.在细胞水平上,以DCFH-DA为探针和抗氧化剂NAC,研究Cu@Fe3O4NPs对PANC-1细胞ROS生成的影响。5.利用Annexin V-FITC试剂盒、凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、荧光显微镜和流式细胞技术,研究Cu@Fe3O4NPs对PANC-1细胞凋亡的影响。6.利用RNA测序技术（RNA-seq）,研究Cu@Fe3O4NPs对PANC-1细胞基因转录的影响。7.利用GO和KEGG,对差异基因进行功能富集,研究Cu@Fe3O4NPs抑制PANC-1细胞增殖的可能机制。8.利用PCR技术,对候选基因进行验证,明确p53-Fas-Caspases通路在Cu@Fe3O4NPs诱导PANC-1细胞调亡中的变化。9.利用健康的昆明小鼠,基于铁含量和铜含量进行药物剂量探索,研究Cu@Fe3O4NPs体内给药的安全剂量。10.利用ROS试剂盒和MDA试剂盒,研究Cu@Fe3O4NPs对昆明小鼠肝脏组织氧化应激相关因子的影响。11.利用SOD、CAT、GSH、GPX试剂盒,研究Cu@Fe3O4NPs对昆明小鼠肝脏组织抗氧化应激相关因子的影响。12.利用谷丙转氨酶和谷草转氨酶试剂盒,研究Cu@Fe3O4NPs对昆明小鼠肝脏功能的影响。13.利用肌酐和尿素氮试剂盒,研究Cu@Fe3O4NPs对昆明小鼠肾脏功能的影响。结果:1.Cu@Fe3O4NPs能够抑制体外培养的PANC-1和CFPAC-1细胞增殖,且呈现一定程度的时间-效应依赖性和剂量-效应依赖性。不同浓度Cu@Fe3O4NPs（0.04-5μM）处理PANC-1细胞24 h,其抑制细胞增殖的起始浓度为0.31μM,抑制率为4.53%±2.87%,最大浓度对应的抑制率为87.47%±0.61%。不同浓度Cu@Fe3O4NPs（0.04-5μM）处理PANC-1细胞48h,其抑制细胞增殖的起始浓度为0.04μM,抑制率为10.07%±2.53%,最大浓度的抑制率为93.86%±0.66%,提示不同浓度的Cu@Fe3O4NPs对PANC-1细胞具有剂量依赖性。在24 h和48 h,Cu@Fe3O4NPs抑制PANC-1的IC50分别为2.034μM,95%的可信区间为（1.76-2.35μM）和1.55μM,95%的可信区间为（1.07-2.21μM）,提示Cu@Fe3O4NPs对PANC-1细胞的抑制具有时间依赖性。不同浓度Cu@Fe3O4NPs（0.03-4μM）处理CFPAC-1细胞24 h,其抑制细胞增殖的起始浓度为0.5μM,抑制率为10.73%±5.57%,最大浓度对应的抑制率为85.85%±1.68%。不同浓度Cu@Fe3O4NPs（0.03-4μM）处理CFPAC-1细胞48 h,其抑制细胞增殖的起始浓度为0.06μM,抑制率为5.20%±2.07%,最大浓度的抑制率为90.89%±0.60%,提示不同浓度的Cu@Fe3O4NPs对CFPAC-1细胞具有剂量依赖性。在24 h和48 h,Cu@Fe3O4NPs抑制CFPAC-1的IC50分别为1.54μM,95%的可信区间为（1.32-1.80μM）和1.03μM,95%的可信区间为（0.36-3.50μM）,提示Cu@Fe3O4NPs对CFPAC-1细胞的抑制具有时间依赖性。2.Cu@Fe3O4NPs能够抑制人胰腺癌CFPAC-1细胞异种移植瘤生长。2.5 mg/kg Cu@Fe3O4NPs组异种移植瘤的生长抑制率为33.56%±23.99%;5 mg/kg Cu@Fe3O4NPs组异种移植瘤的生长抑制率为45.48%±28.53%。提示有一定的剂量依赖性。根据体内抗肿瘤试验评价标准:肿瘤生长抑制率大于40%,说明抗肿瘤治疗有效。因此,5 mg/kg Cu@Fe3O4NPs能够有效抑制人胰腺癌细胞CFPAC-1异种移植瘤的生长。通过体内外实验,初步证明Cu@Fe3O4NPs能够明显抑制人胰腺癌细胞增殖,并呈现了一定的时间依赖性和剂量依赖性,但其具体机制尚不清楚。因此,我们拟利用PANC-1细胞株,研究不同浓度Cu@Fe3O4NPs（1-2μM剂量范围）的抗胰腺癌作用机制研究。3.Cu@Fe3O4NPs能够诱导ROS生成。在无机化学反应体系中,Cu@Fe3O4NPs能够产生ROS。在常温常压环境中,0.08 m M Cu@Fe3O4NPs反应体系在0.5 h ROS的生成率为27.13%±0.07%,在1 h ROS的生成率为44.86%±0.11%。在细胞水平上,Cu@Fe3O4NPs能够诱导PANC-1细胞产生大量ROS,在12 h内ROS的生成与1.5和2μM的Cu@Fe3O4NPs存在一定的剂量关系,即Cu@Fe3O4NPs浓度越高,ROS的生成量越高;在1-6 h内,ROS的生成与Cu@Fe3O4NPs存在一定的时间关系,即作用时间越久,ROS的生成量越高。提示无论是在无机化学反应体系中,还是在细胞培养环境下,Cu@Fe3O4NPs均可以诱导ROS生成。4.Cu@Fe3O4NPs能够通过生成ROS诱导细胞死亡。在有无抗氧化剂NAC条件下,2μM Cu@Fe3O4NPs能够明显抑制PANC-1细胞增殖,抑制率为75.15±2.00%;当加入NAC时,2μM Cu@Fe3O4NPs对增殖抑制率明显降低,此时的抑制率为6.26±8.56%。NAC可以明显缓解Cu@Fe3O4NPs对PANC-1细胞增殖的抑制作用,提示Cu@Fe3O4NPs所诱导的细胞死亡是有ROS引起的。5.Cu@Fe3O4NPs可以诱导胰腺癌细胞PANC-1凋亡。Annexin V-FITC/PI染色显示,1.5μΜCu@Fe3O4NPs处理PANC-1细胞24 h,镜下可见大量绿色荧光（Annexin V-FITC染色）,部分细胞带有红色荧光（PI染色）,凋亡抑制剂Z-VAD-FMK可明显减少阳性染色细胞数量;流式细胞技术显示,1.5μΜCu@Fe3O4NPs可以诱导PANC-1凋亡,其早期凋亡率为5.28%±0.41%,晚期凋亡率为23.35%±2.80%,因此,Cu@Fe3O4NPs可以诱导PANC-1细胞凋亡。细胞增殖活力实验显示,1.5μΜCu@Fe3O4NPs对PANC-1细胞的抑制作用可被Z-VAD-FMK明显缓解,提示诱导细胞凋亡是Cu@Fe3O4NPs引起胰腺癌细胞死亡的主要方式。6.Cu@Fe3O4NPs可能通过p53-Fas-Caspases通路诱导PANC-1细胞凋亡。RNA-seq结果显示,1.5μM的Cu@Fe3O4NPs组与对照组之间的差异表达基因有2367个,其中上调的基因有1032个,下调的基因有1335个。通过GO和KEGG生物富集功能,显示p53通路有21个基因,其中p53、Fas、caspase8和caspase3均表达上调;利用PCR对上述基因进行验证,结果与RNA-seq一致,p53、Fas、caspase8和caspase3表达均上调,提示Cu@Fe3O4NPs可能p53-Fas-caspases通路诱导PANC-1细胞凋亡。7.Cu@Fe3O4NPs对于昆明小鼠的安全剂量范围为0-7.8 mg/kg,在此范围内对小鼠基本状态无明显影响。1.56 mg/kg和7.8 mg/kg Cu@Fe3O4NPs对小鼠肝脏的氧化应激指标ROS和MDA的水平无明显影响;对抗氧化应激相关因子SOD、CAT、GSH、GPX的水平未见明显影响;对肝功能指标谷草转氨酶和谷丙转氨酶均无明显影响;对肾功能指标肌酐和尿素氮均无明显的变化。Cu@Fe3O4NPs对于昆明小鼠的致死剂量是11.7 mg/kg。以上结果提示,在受试剂量7.8 mg/kg以下,Cu@Fe3O4NPs对小鼠体尚未发现明显毒性作用。结论:1.在体内外实验中,Cu@Fe3O4NPs对人胰腺癌细胞增殖均有抑制作用。2.Cu@Fe3O4NPs能够通过生成ROS,激活p53、Fas、caspase8和caspase3,诱导PANC-1细胞凋亡。3.在受试剂量7.8 mg/kg以下,Cu@Fe3O4NPs对小鼠体尚未发现明显毒性作用。