【摘 要】
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由芸苔属根肿菌（Plasmodiophora brassicae）引起的根肿病对十字花科作物的经济价值具有严重威胁,是全世界范围亟待解决的问题。很多专家已对根肿菌抗病基因进行了定位,其中Rcr1与Rcr2定位到了共同的候选基因Bra A03g049860.3C,但抗根肿病相关的机制研究尚未报道。本研究中发现Bra A03g049860.3C与拟南芥霜霉菌寄主受体（Recognition of Pe
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由芸苔属根肿菌（Plasmodiophora brassicae）引起的根肿病对十字花科作物的经济价值具有严重威胁,是全世界范围亟待解决的问题。很多专家已对根肿菌抗病基因进行了定位,其中Rcr1与Rcr2定位到了共同的候选基因Bra A03g049860.3C,但抗根肿病相关的机制研究尚未报道。本研究中发现Bra A03g049860.3C与拟南芥霜霉菌寄主受体（Recognition of Peronospora parasitica1,RPP1）同源,故命名为BrRPP1。该基因的cDNA序列在抗/感材料中存在差异。为了进一步验证该基因的抗病功能以及抗病机制,我们设计了后续实验;通过对BrRPP1的拟南芥同源缺失突变体与野生型进行根肿菌侵染观察,验证了BrRPP1的抗病功能;对抗/感材料BrRPP1的启动子区域进行克隆与元件分析比对,预测BrRPP1的调控机制;对BrRPP1进行亚细胞定位分析,确定了BrRPP1在细胞内的表达模式;构建了酵母双杂交载体,筛选出了目的基因的互作蛋白;得到结果如下:1.抗/感病材料中BrRPP1的cDNA在编码LRR结构域处存在多处碱基突变,导致了氨基酸序列的差异,与三维结构的改变。生物信息学预测发现,BrRPP1在大白菜抗/感材料中性质一致,都含有TIR与LRR等保守结构域,属于类TIR-NBS-LRR（TIR-NBS-LRR）蛋白,是植物ETI反应中的R蛋白,是一种无跨膜结构的非分泌性亲水性蛋白。2.对BrRPP1的拟南芥基因同源缺失突变体‘SALK＿065253’进行抗根肿病功能鉴定,使用光学显微镜分别在接种根肿菌后24h,48h,72h对拟南芥根部进行观察,发现拟南芥突变体‘SALK＿065253’更易受到根肿菌的侵染,侧面验证了BrRPP1的抗根肿病作用。3.构建了BrRPP1的GFP融合表达载体pGPTVII.GFP-BrRPP1,使用农杆菌转化法将该载体瞬时转化入本氏烟草,以空载体为对照。通过激光共聚焦显微镜观察,发现对照空载体的GFP荧光信号存在于细胞核与细胞膜上,而pGPTVII.GFP-BrRPP1融合载体仅在细胞核发出GFP荧光信号,最终将BrRPP1定位在细胞核内。4.构建了BrRPP1的Bait载体pGBKT7-BrRPP1,与酵母双杂cDNA文库进行Mating杂交,筛选得到11种互作蛋白,分别为:参与细胞壁修饰的植物半乳糖醛糖基转移酶,参与茉莉酸合成的磷脂酶A1,参与细胞程序性死亡的细胞色素C。以及可能参与活性氧产生的光合作用相关蛋白,HNH核酸酶（His-Asn-His endonuclease）,磷酸核酮糖激酶（phosphoribulokinase）以及氧增强蛋白（oxygen-evolving enhancer protein）,其余蛋白功能尚未知。5.为了进一步了解该基因的上游调控机制,对BrRPP1抗/感材料上游1167bp的启动子区域序列进行扩增与测序,测序结果使用DNAMAN与Plant CARE在线分析,最终发现了WRKY,MYB,MYC等转录因子以及脱落酸,抗氧化反应元件（anti-oxidative response element,ARE）等结合位点,并发现了抗/感材料中MYC,ARE,ARBE等启动子元件的数量差异,启动子相关调控机制有待进一步研究。
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