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树突状细胞(Dendritic cell, DC)是机体免疫系统非常重要的一类抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell, APC)，是目前已知的抗原提呈功能最强的专职APC，可启动并调节免疫应答，有效刺激T、B淋巴细胞活化，在抗肿瘤、抗感染、移植排斥以及自身免疫性疾病发病过程中起重要作用。研究表明，肿瘤患者缺乏有力的抗肿瘤免疫应答，可能原因之一是肿瘤细胞抗原性弱、患者APC功能低下，使肿瘤抗原不能被有效提呈给淋巴细胞。因此，通过体外扩增DC并增强其抗原提呈功能，建立以DC为基础的主动特异性免疫治疗，逐渐成为肿瘤免疫治疗的主要研究方向。以肿瘤患者骨髓、外周血CD34~+细胞或CD14~+细胞为来源，体外诱导培养DC，再以自体 祭一军匹大甘顷＊时伍岱人一肿瘤细胞抗原致敏DC后回输患者，激发体内特异性抗肿瘤免疫反应，这是目前DC用于临床抗肿瘤免疫治疗的一个基本思路。 目的：本研究以经动员富集的肿瘤患者外周血单个核细胞 （Mononuclear cell，MNC）为来源，建立体外诱导培养 DC的方怯；以健康供者MN C为对照，检测患者＊C的形态、表型及功能：并研究经肿瘤细胞冻融抗原致敏的DC在体外诱导特异性杀伤肿瘤细胞的效应。 方法： 1．DC的诱导及鉴定：以化疗联合皮下注射G－CSF对肿瘤患者及单独以G－CSF对正常人进行外周血干细胞动员，血细胞分离机分离富集外周血MNC，经淋巴细胞分离液梯度离心、聚苯乙烯细胞培养板贴壁纯化后，加入含10％FCS的RPMll640，以GM－CSF和IL4联合诱导DC分化，诱导d6加入TNF心促进DC成熟。分别以倒置显微镜、电子显微镜观察DC形态变化；FCM检测细胞表型变化；卜汀 法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。 ＊自体血浆培养 DC：以患者自体血浆（Autologous plasma，AP）代替FCS，余培养条件不变，对患者来源的细胞进行诱导培养，观察其形态、表型变化及刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力，并与FCS培养的DC进行比较。 3．体外细胞毒实验：以肝癌细胞株HepGZ冻融抗原致敏患者DC，作为DC疫苗（HepDC人取患者外周静脉血单个核细胞0BMC）中非贴壁细胞（淋巴细胞，L），调整细胞密度为 IXI 06／mL，以含 －7－ 第·军0 ＾穆’＊碌位～大一IL工、10％FCS的 RPMll640培养；将 HepoC以 SX 10‘／mL密度加入上述淋巴细胞中，共同孵育72h（设未致敏DC组和单独淋巴细胞组为对照），分别称混合培养细胞为HepDC｛、DCL和L。以HepDC－L、DC士和 L作为效应细胞，肝癌细胞株 HepGZ、SNIMC772及白血病细胞株K562为靶细胞，以不同效靶比（5：l、10：l、20：l、40＊）接种于96孔板，48h后MTT法测定效应细胞对各肿瘤细胞的杀伤作用。 结果： ！．细胞形态及表型变化：诱导后，患者DC显示出典型的树突状细胞形态及表型特征。其中，诱导 ds（加 TNFQ活化48h），各抗原表达量明显升高，分别为：CDllc（92．27士4．88）％、CDla（45．30土5．40）％、CD86（61．57土6．88）％、CD80（54石3土4二5）％、HLA0R （82．88土二．32）％，为典型DC表型；健康对照DC各抗原表达量为CDI Ic（88．19土 1．35）％、CDla（44．43土6．12）o／o、CD86（64．43土490）？b、CD80（51．gi士2．95）％、HLA－DR（88．引上二石8）O／O，二者间无显著性差异（P＞0刀5）。 2．DC刺澈T细胞增碴活性：混合淋巴细胞反应结果显示，患者DC具有高效地刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力，其刺激指数 （SI）与健康对照 DC的 SI无显著差异（P＞0刀5）；两种来源 DC各浓度的n与PBMC的m比较，有显著性差异（P＜0．05）。 3．自体血浆培养DC：以患者自体血浆（AP）代替FCS培养DC（AP－DC），加 TNFa活化后，细胞也高表达 CD、CD、 ．吕－ 4，fkkq4deftWI一CD86、CD80、HLA－DR等表面抗原，分别为（95．56土 l．83）O、（43．99土5．96）O、O4．09士0．92）0、（60．of土 11．35）O、（gi．73土 l．96）％，与＊＊｝＊C比较，＊086、N＊人＊R表达量显著升高（P＜0刀5）。另外，。＼P0C也具有高效刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。 4．DD诱导特异性杀伤效应：不同效靶比，HepDC＊均显示对HepGZ肝癌细胞高效特异的杀伤活性，杀伤率分别为：二36土二厂7 （E＊为5：1）、30．9土1．叨（IO：互）、44二土二．19（凹：二）、5二3上二84 （山）：1），显著高于＊＊＊组和单纯L组（尸＜0刀5）：同一效靶比时门0：1和叩：1），Nep＊OL对NepC的杀伤率明显高于对另一肝癌细胞株SNI＼IC7721和白血病细胞株K562的杀伤率（尸＜0．05），对后两种细胞的杀伤率与另两组效应细胞（DC1组和单纯L组）无显著性差异（尸＞0刀5）。 结论：以肿瘤患者经动员富集的外周血NmC为来源，联合应用GN！－CSF、L－斗及yFa，在体?