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背景和目的近年来,寨卡病毒（ZIKV）在许多的国家和地区流行,通过母婴垂直传播导致婴儿一系列先天性综合征（如小头症等）,以及格林-巴利综合征也跟ZIKV感染有关。目前,还没有获得批准上市的ZIKV疫苗。丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的全球流行的传染病,大约有1.75亿人感染HCV,而HCV慢性感染会导致肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞癌。虽然HCV抗病毒药物（DAAs）治疗可获得90%以上持续病毒学应答（SVR）,但仍不能根除病毒,容易出现耐药性变异,更不能预防HCV新发感染。因此,HCV疫苗是预防HCV感染最有效的策略。新型腺病毒载体是理想的疫苗载体,能够诱导产生高水平体液和细胞免疫反应,因此,本课题基于两种自主研发的新型腺病毒载体制备ZIKV和HCV疫苗。方法基于人群中低流行率的猴腺病毒23型（SAdV23）和人腺病毒49型（HAdV49）基因组,利用直接分子克隆和Gibson Assembly方法构建获得复制缺陷型腺病毒载体Sad23L和Ad49L,以此作为研制ZIKV与HCV疫苗的载体。以ZIKV的前膜及囊膜蛋白（prM-E）为疫苗靶抗原,制备ZIKV疫苗株Sad23L-prM-E;选用我国华南和东南亚地区流行率最高的HCV-1b/6a基因亚型毒株,以其结构蛋白（E1E2）和非结构蛋白（NS3-5B）为免疫原,制备Sad23L-HCV-1b/6a 和 Ad49L-HCV-1b/6a 疫苗株。以小鼠（C57BL/6）评价新型腺病毒载体ZIKV或HCV疫苗株的免疫原性,分离血清,通过ELISA测定结合抗体,PRNT50测定中和抗体水平,分离脾脏淋巴细胞通过ELISpot和ICS测定细胞免疫反应;以普通棉耳狨猴评价ZIKV疫苗Sad23L-prM-E的免疫保护效果,取血液和体液检测病毒载量。结果1.构建获得了两种复制缺陷型新型腺病毒载体Sad23L和Ad49L,共缺失了早期转录单位E1和E3,而且E4orf6区被Ad5-E4orf6替换,获得高感染性滴度重组病毒（＞1011 PFU/ml）。2.采用 Sad23L载体制备了ZIKV疫苗株 Sad23L-prM-E,分别以 5×106、5×107、5×108PFU三个不同剂量,单次接种小鼠（n=5/组）测定疫苗免疫原性,其诱导产生的E蛋白特异性结合抗体（E-Ab）和中和抗体（NAb）滴度分别为102.26、102.73、103.15 和 101.78、102.57、102.95;特异性细胞免疫反应为 66-388 SFCs/106 cells（M）和 278-786 SFCs/106 cells（E）。以 3×108PFU Sad23L-prM-E 单次肌肉接种狨猴（n=3）,诱导产生了 104.07的E-Ab和103.13的NAb,以及E蛋白诱导产生特异性分泌IFN-γ的T细胞反应为1219 SFCs/106 cells。3.采用105 PFU的野生型ZIKV经肌肉注射攻击Sad23L-prM-E疫苗免疫的狨猴（n=3）和对照组狨猴（n=2）,经跟踪测定显示免疫组的血液和体液中出现短暂低水平病毒载量（＜103 copies/ml）,比对照组病毒载量减少了 100倍,对照组狨猴的血液和体液中有着更高（105.73 copies/ml）和持续时间更久（9天）的病毒载量（P＜0.05）。4.采用Sad23L和Ad49L载体,以HCV-1b/6a的E1E2/NS3-5B为靶抗原制备8株新型腺病毒载体HCV疫苗候选株,包括Sad23L-HCV1b-E1E2、Sad23L-HCV1b-NS3-5B、Sad23L-HCV6a-E1E2、Sad23L-HCV6a-NS3-5B、Ad49L-HCV1b-E1E2、Ad49L-HCV1b-NS3-5B、Ad49L-HCV6a-E1E2 和Ad49L-HCV6a-NS3-5B。大量制备与纯化了各疫苗株疫苗,其感染性滴度＞1011 PFU/ml。5.采用C57BL/6小鼠（n=5/组）,分别单独接种三个不同剂量的8个新型腺病毒载体HCV疫苗4周后,测定疫苗诱导的特异性抗体与细胞免疫反应水平。ELISA（OD450）数据显示,Sad23L-HCV1b-E1E2诱导产生E2结合抗体最高水平为 0.409,Sad23L-HCV6a-E1E2 为 0.187,Ad49L-HCV1b-E1E2 为 0.306,Ad49L-HCV6a-E1E2为0.155。结果表明,4株HCV疫苗单次接种免疫小鼠,可以诱导产生针对HCV囊膜蛋白E2的抗体,但抗体水平相对较低,提示应进一步加强免疫。6.特异性细胞免疫反应测定结果显示,Sad23L-HCV1b-E1E2、Sad23L-HCV6a-E1E2、Ad49L-HCV1b-E1E2 和 Ad49L-HCV6a-E1E2 最高剂量诱导的特异性IFN-γ分泌的T细胞反应分别为719.2、146.5、739.6和263 SFCs/106 cells（E1）,353.6、340、406.8和443 SFCs/106 cells（E2）;Sad23L-HCV1b-NS3-5B、Sad23L-HCV6a-NS3-5B、Ad49L-HCV1b-NS3-5B和Ad49L-HCV6a-NS3-5B 最高免疫剂量诱导的特异性IFN-γ分泌的T细胞反应分别为649.2、276.4、429和201.5 SFCs/106 cells（NS3）,81.6、98.4、80.2 和 109 SFCs/106 cells（NS4）,70.2、46、96.2 和 46.75 SFCs/106 cells（NS5）。经四聚体检测,Sad23L-HCV1b-NS3-5B最高免疫剂量组的NS3特异性CD8+T细胞比例在脾脏淋巴细胞中为9.11%,在肝脏淋巴细胞中为12.13%;Ad49L-HCV1b-NS3-5B最高免疫剂量组的NS3特异性CD8+T细胞比例在脾脏淋巴细胞中达到10.08%,在肝脏淋巴细胞中为6.45%。结果显示8个新型腺病毒载体HCV疫苗株针对不同HCV抗原均能诱导较强特异性细胞免疫反应。结论1.构建了两种新型腺病毒载体Sad23L和Ad49L,可用于疫苗研制。2.研制了 ZIKV疫苗Sad23L-prM-E,单次接种小鼠和狨猴均产生高水平的体液和细胞免疫反应,能够有效保护狨猴抵御ZIKV感染,为临床试验提供了重要依据。3.基于两种新型腺病毒载体Sad23L和Ad49L,构建了含两个HCV基因亚型（1b/6a）的结构蛋白（E1E2）与非结构蛋白（NS3-5B）疫苗株,合计8个HCV疫苗株。采用小鼠分别对8个HCV疫苗株进行了免疫原性初步测定,证实8株HCV疫苗均可诱导产生特异性抗体和细胞免疫反应;适宜的免疫接种剂量为109PFU,为进一步以Sad23L-HCV疫苗初次免疫、Ad49L-HCV疫苗二次加强免疫,即实施“基础加强化”疫苗免疫方案提供了基础数据。创新之处1.Sad23L和Ad49L载体为我国为数少有的、拥有完全自主知识产权的疫苗载体,具有高感染性滴度优势。2.首次以小型灵长类动物狨猴的感染模型,证实研制的Sad23L-prM-E疫苗能够抵御高滴度ZIKV攻毒,为临床试验提供了依据。3.首次尝试了同时制备两个HCV主要基因型、E1E2/NS3-5B两种类型靶抗原、同时利用Sad23L和Ad49L两种载体制备8个HCV疫苗株,揭示了各HCV疫苗株的免疫原性,为实施“基础加强化”疫苗免疫策略奠定了基础。